PURSUE ULTIMATE FACTS

2023-02-07
Kiss the Son


Kiss the Son
by Daniel Brunz


Why do the nations rage?
And why do the people plot in vain?
The kingdoms of earth align themselves against the LORD and His Messiah
Trying to defy His power and erase the Word that He’s set down
But He who sits in heaven just laughs
He just laughs


He’ll warn them in His wrath
And he will say…


I have placed my King in heaven before whom all knees shall bow
I have placed my King in heaven, King of Kings and Lord of Lords
I have placed my King in heaven, President of Presidents
I have placed my King in heaven


For God has said, “You are my son”
For God has said to Jesus, “You’re my son”
So ask of Me and I will give You all the nations of the world
Ask of Me and I will give You all the nations of the world
Ask of Me and I will give You all the nations of the world
Ask of Me and I will give You…


For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s


What rises up against the LORD will come back to earth where it belongs
For He will not share His glory with another, much less with foolish men
For the LORD is God, Jesus is King
And no new trend or political scheme will ever amount to more than dirt
Compared to the wisdom of His Word
For there’s nothing new under the sun
Men just rearrange what’s already been done
For God created the heart of man
And everything’s under His command
So to those who try to dethrone God: His Word will stand!


He will rule them with a rod of iron and shatter them like clay
He will rule them with a rod of iron and shatter them like clay
Just like it’s nothing
He’ll set them down
In their place


So be wise you kingdoms of the earth
So be wise you Hollywoods of earth
So be wise you rock stars of the earth
So be wise you politicians of earth


And worship the LORD in fear, and rejoice with trembling
And worship the LORD in fear, and rejoice with trembling


And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son…


For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s and the fullness thereof
For the earth is the LORD’s


And worship the LORD in fear, and rejoice with trembling
And worship the LORD in fear, and rejoice with trembling


And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son, kiss the Son, yeah, Kiss the Son
And kiss the Son, yeah, kiss the Son…


And He won’t be angry and You won’t perish in your way
For His wrath can come at once


Happy are those who trust in Him
Happy are those who trust in Him
Happy are those who trust in Him


The fear of the LORD is the beginning of wisdom

列国为什么彼此串通?
万族之民为什么谋算
不能成功的事呢?
地上君王列阵站着,
众人君一同阴谋,
要敌挡永恒主,敌挡他所膏立的,说:
『我们来挣开他们的捆绑,
来脱掉他们的绳索吧。』


那坐在天上的必冷笑;
永恒主必嗤笑他们。
那时他必气忿忿责备他们,
必发烈怒使他们惊惶;
传谕旨说:
『我,我已立我的君王
于锡安、我的圣山上。』
受膏者说:『我必传永恒主的谕旨;
永恒主曾对我说:「你是我的儿子,
我今日生了你。
你求我,我便将列国赐给你为产业,
将地极作为你的田产。
你必用铁杖打破他们;
你必摔碎他们、如窰匠的瓦器。」』


现在呢、君王啊,你们要机警些;
地上审判官哪,你们该听忠告。
要存畏惧心来事奉永恒主,
要战兢兢快乐,
要纯诚诚亲嘴拜服,
恐怕他发怒,你们就在路中灭亡;
因为他的怒气很快就要发作。


凡避难于他里面的都有福啊。


(诗篇 2:1-12 吕振中)

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2023-02-07
Everything He Does Shall Prosper


Everything He Does Shall Prosper
by Lance Edward


Blessed is the man who does not heed the counsel of this world
Blessed is the man who does not conform to worldly ways


For his delight is in the law of the LORD
And on His Word he meditates day and night


And he shall be like a tree by streams of water
That yields abundant fruit in every season
And his leaves shall never, never wither
And everything he does shall prosper
And everything he does shall prosper
And everything he does shall prosper


But the wicked are not so
For they are like the chaff the wind blows away
And the wicked shall not stand in the judgment
For the LORD knows the way of the righteous
But the evil ways of man shall pass away
Shall pass away
They’ll pass away
Forever

不依恶人的计谋而行,
不站在罪人的道路,
不坐在亵慢人的座位,
这人有福啊!
他所喜爱的、是永恒主的律法,
他昼夜所思想的、也是主的律法。


他好像一棵树、移植于流水沟旁,
按节候结果子,
其叶子总不凋残;
凡他所作的、尽都顺利。


恶人却不是这样:
恶人乃像糠粃、给风吹散而飘荡。
因此当审判时、恶人必站不住:
在义人会中、罪人必立不住脚。
因为永恒主知照义人的道路;
恶人的道路必灭没。


(诗篇 1:1-6 吕振中)

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2023-02-04
Add Tabs to My Blog

In [ ]:
cd hexo
In [ ]:
git clone https://github.com/next-theme/hexo-theme-next themes/next
Cloning into 'themes/next'...
remote: Enumerating objects: 6276, done.
remote: Counting objects: 100% (187/187), done.
remote: Compressing objects: 100% (114/114), done.
remote: Total 6276 (delta 76), reused 156 (delta 68), pack-reused 6089
Receiving objects: 100% (6276/6276), 1.31 MiB | 949.00 KiB/s, done.
Resolving deltas: 100% (4051/4051), done.
In [ ]:
mkdir -p themes/freemind/scripts/tags
In [ ]:
cat << EOF > themes/freemind/scripts/tags/index.js
/* global hexo */

'use strict';

const postTabs = require('./tabs')(hexo);

hexo.extend.tag.register('tabs', postTabs, true);
hexo.extend.tag.register('subtabs', postTabs, true);
hexo.extend.tag.register('subsubtabs', postTabs, true);
EOF
In [ ]:
touch themes/freemind/scripts/tags/tabs.js
In [ ]:
cat themes/freemind/scripts/tags/tabs.js
/**
 * tabs.js | https://theme-next.js.org/docs/tag-plugins/tabs
 */

'use strict';

module.exports = ctx => function(args, content = '') {
  const tabBlock = /<!--\s*tab (.*?)\s*-->\n([\w\W\s\S]*?)<!--\s*endtab\s*-->/g;

  args = args.join(' ').split(',');
  const tabName = args[0];
  const tabActive = Number(args[1]) || 0;

  let tabId = 0;
  let tabNav = '';
  let tabContent = '';

  if (!tabName) ctx.log.warn('Tabs block must have unique name!');
  const matches = content.matchAll(tabBlock);

  for (const match of matches) {
    let [caption = '', icon = ''] = match[1].split('@');
    let postContent = match[2];

    postContent = ctx.render.renderSync({ text: postContent, engine: 'markdown' }).trim();

    const abbr = tabName + ' ' + ++tabId;
    const href = abbr.toLowerCase().split(' ').join('-');

    icon = icon.trim();
    if (icon.length > 0) {
      if (!icon.startsWith('fa')) icon = 'fa fa-' + icon;
      icon = `<i class="${icon}"></i>`;
    }

    caption = icon + caption.trim();

    const isActive = (tabActive > 0 && tabActive === tabId) || (tabActive === 0 && tabId === 1) ? ' active' : '';
    tabNav += `<li class="tab${isActive}"><a href="#${href}">${caption || abbr}</a></li>`;
    tabContent += `<div class="tab-pane${isActive}" id="${href}">${postContent}</div>`;
  }

  tabNav = `<ul class="nav-tabs">${tabNav}</ul>`;
  tabContent = `<div class="tab-content">${tabContent}</div>`;

  return `<div class="tabs" id="${tabName.toLowerCase().split(' ').join('-')}">${tabNav + tabContent}</div>`;
};

Here is English.

这里是中文。

ここは日本語テキストです。

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2022-10-18
Try Bacalhau

In [ ]:
curl -sL https://get.bacalhau.org/install.sh | bash
Your system is darwin_amd64
No BACALHAU detected. Installing fresh BACALHAU CLI...
Getting the latest BACALHAU CLI...
Installing v0.3.3 BACALHAU CLI...
Downloading https://github.com/filecoin-project/bacalhau/releases/download/v0.3.3/bacalhau_v0.3.3_darwin_amd64.tar.gz ...
Downloading sig file https://github.com/filecoin-project/bacalhau/releases/download/v0.3.3/bacalhau_v0.3.3_darwin_amd64.tar.gz.signature.sha256 ...
Verified OK
Extracting tarball ...
NOT verifying Bin
bacalhau installed into /usr/local/bin successfully.
Client Version: v0.3.3
Server Version: v0.3.3
In [ ]:
bacalhau version
Client Version: v0.3.3
Server Version: v0.3.3

Compile Bacalhau CLI into WebAssembly Binaries

In [ ]:
import os
from EdgeGPT import Chatbot as Bing, ConversationStyle

bing = Bing(cookiePath = os.path.expanduser('~/.config/EdgeGPT/cookies.json'))
In [ ]:
res = (await bing.ask(
    prompt = '''
Simulate the process of compiling Bacalhau CLI into WebAssembly Binaries. And summarize your actions and results.
''',
    conversation_style = ConversationStyle.balanced,
))['item']['messages'][1]

print(res['text'])
print('\n---\n')
print(res['adaptiveCards'][0]['body'][0]['text'])
Compiling Bacalhau CLI into WebAssembly binaries is a multi-step process. Here are the steps:

1. Install Rust and wasm-pack. You can install Rust from [here](https://www.rust-lang.org/tools/install) and wasm-pack from [here](https://rustwasm.github.io/wasm-pack/installer/).

2. Clone the Bacalhau CLI repository from [here](https://github.com/bacalhau-crypto/bacalhau-cli).

3. Navigate to the cloned repository and run the following command to build the WebAssembly binaries:

   ```
   wasm-pack build --target web
   ```

   This command will compile the Rust code into WebAssembly binaries and create a JavaScript wrapper for the WebAssembly module.

4. The compiled WebAssembly binaries will be located in the `pkg` directory.

5. To use the compiled WebAssembly binaries in a web application, you can import the JavaScript wrapper and use the exported functions.

I hope this helps! Let me know if you have any other questions.

---

Compiling Bacalhau CLI into WebAssembly binaries is a multi-step process. Here are the steps:

1. Install Rust and wasm-pack. You can install Rust from [here](https://www.rust-lang.org/tools/install) and wasm-pack from [here](https://rustwasm.github.io/wasm-pack/installer/).

2. Clone the Bacalhau CLI repository from [here](https://github.com/bacalhau-crypto/bacalhau-cli).

3. Navigate to the cloned repository and run the following command to build the WebAssembly binaries:

   ```
   wasm-pack build --target web
   ```

   This command will compile the Rust code into WebAssembly binaries and create a JavaScript wrapper for the WebAssembly module.

4. The compiled WebAssembly binaries will be located in the `pkg` directory.

5. To use the compiled WebAssembly binaries in a web application, you can import the JavaScript wrapper and use the exported functions.

I hope this helps! Let me know if you have any other questions.

In [ ]:
res = (await bing.ask(
    prompt = '''
Teach me how to compile Bacalhau CLI into WebAssembly Binaries. And summarize your actions and results.
''',
    conversation_style = ConversationStyle.balanced,
))['item']['messages'][1]

print(res['text'])
print('\n---\n')
print(res['adaptiveCards'][0]['body'][0]['text'])
Sure, I can help you with that. Here are the steps to compile Bacalhau CLI into WebAssembly binaries:

1. Install Rust and wasm-pack. You can install Rust from [here](https://www.rust-lang.org/tools/install) and wasm-pack from [here](https://rustwasm.github.io/wasm-pack/installer/).

2. Clone the Bacalhau CLI repository from [here](https://github.com/bacalhau-crypto/bacalhau-cli).

3. Navigate to the cloned repository and run the following command to build the WebAssembly binaries:

   ```
   wasm-pack build --target web
   ```

   This command will compile the Rust code into WebAssembly binaries and create a JavaScript wrapper for the WebAssembly module.

4. The compiled WebAssembly binaries will be located in the `pkg` directory.

5. To use the compiled WebAssembly binaries in a web application, you can import the JavaScript wrapper and use the exported functions.

I hope this helps! Let me know if you have any other questions.

---

Sure, I can help you with that. Here are the steps to compile Bacalhau CLI into WebAssembly binaries:

1. Install Rust and wasm-pack. You can install Rust from [here](https://www.rust-lang.org/tools/install) and wasm-pack from [here](https://rustwasm.github.io/wasm-pack/installer/).

2. Clone the Bacalhau CLI repository from [here](https://github.com/bacalhau-crypto/bacalhau-cli).

3. Navigate to the cloned repository and run the following command to build the WebAssembly binaries:

   ```
   wasm-pack build --target web
   ```

   This command will compile the Rust code into WebAssembly binaries and create a JavaScript wrapper for the WebAssembly module.

4. The compiled WebAssembly binaries will be located in the `pkg` directory.

5. To use the compiled WebAssembly binaries in a web application, you can import the JavaScript wrapper and use the exported functions.

I hope this helps! Let me know if you have any other questions.

In [ ]:
res = (await bing.ask(
    prompt = '''
介绍 Bacalhau CLI。如何将 Bacalhau CLI 编译成 WebAssembly 二进制文件?总结你的步骤和结果。
''',
    conversation_style = ConversationStyle.balanced,
))['item']['messages'][1]

print(res['text'])
print('\n---\n')
print(res['adaptiveCards'][0]['body'][0]['text'])
Bacalhau CLI 是一个用于在 Bacalhau 平台上运行任务的命令行工具。根据 Bacalhau 的文档,你需要将你的程序编译成 WASI-compliant WebAssembly。你可以查看你的编译器的说明来了解如何执行此操作。例如,Rust 用户可以指定 wasm32-wasi 目标来 rustup 和 cargo 来编译为 WASI WebAssembly [^2^]。

你可以参考这篇文章 [^9^] 和这篇文章 [^10^] 来了解如何将 C++ 项目编译成 WebAssembly。这篇文章 [^11^] 可以让你更好地了解 WebAssembly。

---

[1]: https://developer.mozilla.org/zh-CN/docs/WebAssembly/C_to_wasm "编译 C/C++ 为 WebAssembly - WebAssembly | MDN"
[2]: https://docs.bacalhau.org/getting-started/wasm-workload-onboarding/ "Onboarding Your WebAssembly Workloads | Bacalhau Docs"
[3]: https://github.com/bacalhau-project/bacalhau "GitHub - bacalhau-project/bacalhau: Compute over Data framework for ..."
[4]: https://zhuanlan.zhihu.com/p/258560278 "记一次完整 C++ 项目编译成 WebAssembly 的实践 - 知乎"
[5]: https://developer.mozilla.org/zh-CN/docs/WebAssembly/C_to_wasm "编译 C/C++ 为 WebAssembly - WebAssembly | MDN"
[6]: https://docs.bacalhau.org/getting-started/wasm-workload-onboarding/ "Onboarding Your WebAssembly Workloads | Bacalhau Docs"
[7]: https://github.com/bacalhau-project/bacalhau "GitHub - bacalhau-project/bacalhau: Compute over Data framework for ..."
[8]: https://juejin.cn/post/7013286944553566215 "快 11K Star 的 WebAssembly,你应该这样学 - 掘金"
[9]: https://juejin.cn/post/7013286944553566215 "快 11K Star 的 WebAssembly,你应该这样学 - 掘金"
[10]: https://juejin.cn/post/6914148755738460168 "c++项目转成wasm全过程 - 掘金"
[11]: https://www.jianshu.com/p/bff8aa23fe4d "几张图让你看懂WebAssembly - 简书"

Bacalhau CLI 是一个用于在 Bacalhau 平台上运行任务的命令行工具。根据 Bacalhau 的文档,你需要将你的程序编译成 WASI-compliant WebAssembly。你可以查看你的编译器的说明来了解如何执行此操作。例如,Rust 用户可以指定 wasm32-wasi 目标来 rustup 和 cargo 来编译为 WASI WebAssembly [^1^][2]。

你可以参考这篇文章 [^2^][9] 和这篇文章 [^3^][10] 来了解如何将 C++ 项目编译成 WebAssembly。这篇文章 [^4^][11] 可以让你更好地了解 WebAssembly。

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2022-10-02
Research History of Synaptotagmin-7

Synaptotagmins, such as SYT7, are calcium-dependent phospholipid-binding proteins known for their role in synaptic exocytosis and neurotransmitter release. Significant expression has also been observed in the prostate and other tissues.
—— Wikipedia - Synaptotagmin-7

Two different monoclonal antibodies¹, characterized initially as binding synaptic terminal regions of rat brain, bind a 65,000-dalton² protein, which is exposed on the outer surface of brain synaptic vesicles.
Immunocytochemical experiments³ at the electron microscope level demonstrate that these antibodies⁴ bind the vesicles in many different types of nerve terminals.
The antibodies have been used successfully to purify synaptic vesicles from crude brain homogenates by immunoprecipitation⁵ onto the surface of polyacrylamide beads⁶.
The profiles of the structures precipitated by these beads are almost exclusively vesicular, confirming the vesicle-specificity of the antibodies. In SDS gels⁷, the antibodies bind a single protein of 65,000 daltons.
The two antibodies are not identical, but compete for binding sites on this protein.


Immune competition experiments also demonstrate that the antigenic components⁸ on the 65,000-dalton protein are widely distributed in neuronal and neural secretory tissues. Detectable antigen⁸ is not found in uninnervated tissue - blood cells and extrajunctional muscle.
Low levels are found in nonneural secretory tissues; it is not certain whether this reflects the presence of low amounts of the antigen on all the exocytotic vesicles in these tissues or whether the antigen is found only in neuronal fibers within these tissues.
The molecular weight and at least two antigenic determinants of the 65,000-dalton protein are highly conserved throughout vertebrate phylogeny⁹.
The two antibodies recognize a 65,000-dalton protein present in shark, amphibia, birds, and mammals.
The highly conserved nature of the determinants on this protein and their specific localization on secretory vesicles of many different types suggest that this protein may be essential for the normal function of neuronal secretory vesicles.


—— Matthew, W D, L Tsavaler, and L F Reichardt. “Identification of a Synaptic Vesicle-Specific Membrane Protein with a Wide Distribution in Neuronal and Neurosecretory Tissue.” Journal of Cell Biology 91, no. 1 (October 1, 1981): 257–69. https://doi.org/10.1083/jcb.91.1.257.

¹ monoclonal antibodies =>


A monoclonal antibody (mAb, more rarely called moAb) is an antibody produced from a cell line made by cloning a unique white blood cell. All subsequent antibodies derived this way trace back to a unique parent cell.

—— Wikipedia - Monoclonal antibody


antibodies

² dalton =>


The dalton or unified atomic mass unit (symbols: Da or u) is a unit of mass widely used in physics and chemistry. It is defined as 1/12 of the mass of an unbound neutral atom of carbon-12 in its nuclear and electronic ground state and at rest.

—— Wikipedia - Dalton (unit)

³ Immunocytochemical experiments =>


Immunocytochemistry (ICC) is a common laboratory technique that is used to anatomically visualize the localization of a specific protein or antigen in cells by use of a specific primary antibody that binds to it. The primary antibody allows visualization of the protein under a fluorescence microscope when it is bound by a secondary antibody that has a conjugated fluorophore. ICC allows researchers to evaluate whether or not cells in a particular sample express the antigen in question. In cases where an immunopositive signal is found, ICC also allows researchers to determine which sub-cellular compartments are expressing the antigen.

—— Wikipedia - Immunocytochemistry

antibodies =>


An antibody (Ab), also known as an immunoglobulin (Ig), is a large, Y-shaped protein used by the immune system to identify and neutralize foreign objects such as pathogenic bacteria and viruses.

—— Wikipedia - Antibody

immunoprecipitation =>


Immunoprecipitation (IP) is the technique of precipitating a protein antigen out of solution using an antibody that specifically binds to that particular protein. This process can be used to isolate and concentrate a particular protein from a sample containing many thousands of different proteins. Immunoprecipitation requires that the antibody be coupled to a solid substrate at some point in the procedure.

—— Wikipedia - Immunoprecipitation

polyacrylamide beads =>


Polyacrylamide (abbreviated as PAM) is a polymer with the formula (-CH2CHCONH2-). It has a linear-chain structure. PAM is highly water-absorbent, forming a soft gel when hydrated.

—— Wikipedia - Polyacrylamide

SDS gels =>


SDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gel electrophoresis) is a discontinuous electrophoretic system developed by Ulrich K. Laemmli which is commonly used as a method to separate proteins with molecular masses between 5 and 250 kDa. The combined use of sodium dodecyl sulfate (SDS, also known as sodium lauryl sulfate) and polyacrylamide gel allows to eliminate the influence of structure and charge, and proteins are separated solely on the basis of differences in their molecular weight.

—— Wikipedia - SDS-PAGE

antigenic components =>

antigen =>


In immunology, an antigen (Ag) is a molecule or molecular structure or any foreign particulate matter or a pollen grain that can bind to a specific antibody or T-cell receptor. The presence of antigens in the body may trigger an immune response. The term antigen originally referred to a substance that is an antibody generator. Antigens can be proteins, peptides (amino acid chains), polysaccharides (chains of monosaccharides/simple sugars), lipids, or nucleic acids.

—— Wikipedia - Antigen

vertebrate phylogeny =>


A phylogenetic tree (also phylogeny or evolutionary tree) is a branching diagram or a tree showing the evolutionary relationships among various biological species or other entities based upon similarities and differences in their physical or genetic characteristics. All life on Earth is part of a single phylogenetic tree, indicating common ancestry.

—— Wikipedia - Phylogenetic tree

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2022-09-23
In Search of Memory

In Search of Memory: The Emergence of a New Science of Mind.

  • Kandel, E. R. (2006). In Search of Memory: The Emergence of a New Science of Mind. New York: W. W. Norton & Company.

Synaptic strength is not fixed.

Consolidation
  • The first rigorous test of memory consolidation came in 1949, when the American psychologist C. P. Duncan applied electrical stimuli to the brain of animals during or immediately after training, resulting in convulsions that disrupted memory and caused retrograde amnesia. Producing seizures several hours after training had little or no effect on recall.
  • Almost twenty years later, Louis Flexner at the University of Pennsylvania made the remarkable discovery that drugs that inhibit the synthesis of proteins in the brain disrupt long-term memory if given during and shortly after learning, but they do not disrupt short-term memory. This finding suggested that long-term memory storage requires the synthesis of new proteins.
  • Together, the two sets of studies seemed to confirm the idea that memory storage takes place in at least two stages: a short-term memory lasting minutes is converted -- by a process of consolidation that requires the synthesis of new protein -- into stable, long-term memory lasting days, weeks, or even longer.
Same Storage Sites?
  • Carew, Castellucci, and I found that the same synaptic connections between sensory and motor neurons that are altered in short-term habituation and sensitization are also altered in long-term habituation and sensitization. Moreover, in both cases, the synaptic changes parallel the changes in behavior we observed: in long-term habituation, the synapse is depressed for a period of weeks, whereas in long-term sensitization, it is enhanced for weeks. This suggested that, in the simplest cases, the same site can store both short- and long-term memory and that it can do so for different forms of learning.
Mechanism?
  • Bailey and his colleague, Mary Chen, and Carew and I found that long-term memory is not simply an extension of short-term memory: not only do the changes in synaptic strength last longer but, more amazingly, the actual number of synapses in the circuit changes. Specifically, in long-term habituation the number of presynaptic connections among sensory neurons and motor neurons decreases, whereas in long-term sensitization sensory neurons grow new connections that persist as long as the memory is retained. There is in each case a parallel set of changes in the motor cell.
  • Functional Changes vs. Anatomical Changes
Molecules and Short-Term Memory
  • Release more or less transmitter?
  • Increase/decrease number of receptors?
  • Increase/decrease sensitivity of receptors?

We found that the change is quite one-sided: during short-term habituation lasting minutes, the sensory neuron releases less neurotransmitter, and during short-term sensitization it releases more neurotransmitter.

How? Biochemical Signaling Pathways? By cyclic AMP?

Injected an inhibitor of PKA into a sensory neuron and found that it indeed blocked the ability of serotonin to enhance glutamate release.

In finding that cyclic AMP and protein kinase A are both necessary and sufficient for strengthening the connections between sensory and motor neurons, we were able to identify the first links in the chain of biochemical events leading to short-term memory storage.

Similarly in Mice Hippocampus

In both Aplysia and mice, the late phase of long-term potentiation is strongly affected by modulatory interneurons, which in mice are recruited to switch a short-term, homosynaptic into long-term, heterosynaptic change. In mice those neurons release dopamine, a neurotransmitter commonly recruited in the mammalian brain for attention and reinforcement. Like serotonin in Aplysia, dopamine prompts a receptor in the hippocampus to activate an enzyme that increases the amount of cyclic AMP. However, an important part of the increase in cyclic AMP in the mouse hippocampus occurs in the postsynaptic cell, whereas in Aplysia the increase occurs in the presynaptic sensory neuron. In each case, the cyclic AMP recruits protein kinase A and other protein kinases, which leads to the activation of CREB and the turning on of effector genes.

Memory Genes and Long-Term Memory

Gene Expression

We summarized our views in "The Long and Short of Long-Term Memory", a conceptual review published in 1986 in Nature. In this paper, we proposed that if gene expression was required to convert short-term memory at a synapse into long-term memory, then the synapse stimulated by learning somehow had to send a signal to the nucleus telling it to turn on certain regulatory genes. In short-term memory, synapses use cyclic AMP and protein kinase A inside the cell to call for the release of more neurotransmitters. Goelet and I hypothesized that in long-term memory this kinase moves from the synapse to the nucleus, where it somehow activates proteins that regulate gene expression.

cAMP PKA MAPK CREB
  • We now collaborated with Roger Tsien at the University of California, San Diego and used a method developed by him that allowed us to visualize the location of the cyclic AMP and protein kinase A in the neuron. We found that whereas a single pulse of serotonin increases cyclic AMP and protein kinase A primarily at the synapse, repeated pulses of serotonin produce even higher concentrations of cyclic AMP, causing protein kinase A to move into the nucleus, where it activates genes. Later studies found that protein kinase A recruits another kinase, called MAP kinase, which is also associated with synaptic growth and also migrates to the nucleus. Thus we confirmed our idea that one of the functions of repeated sensitization training -- why practice makes perfect -- is to cause the appropriate signals in the form of kinases to move into the nucleus.
  • Once in the nucleus, what do these kinases do? We knew from recently published studies of non-neuronal cells that protein kinase A can activate a regulatory protein called CREB (cyclic AMP response element-binding protein), which binds to a promoter (the cyclic AMP response element). This suggested to us that CREB might be a key component of the switch that converts short-term facilitation of synaptic connections to long-term facilitation and the growth of new connections.
  • An environmental stimulus -- a shock to an animal's tail activates modulatory interneurons that release serotonin. The serotonin acts on the sensory neuron to increase cyclic AMP and to cause protein kinase A and MAP kinase to move to the nucleus and activate CREB. The activation of CREB, in turn, leads to the expression of genes that changes the function and the structure of the cell.
  • In 1995 Bartsch found that there are in fact two forms of the CREB protein, much as the model of Jacob and Monod might have predicted: one that activates gene expression (CREB-1), and one that suppresses gene expression (CREB-2). Repeated stimulation causes protein kinase A and MAP kinase to move to the nucleus, where protein kinase A activates CREB-1 and MAP kinase inactivates CREB-2. Thus long-term facilitation of synaptic connections requires not only a switching on of some genes, but also the switching off of others.
Specific Synapses?
  • A single sensory neuron has 1200 synaptic terminals and makes contact with about 25 target cells: gill motor neurons, siphon motor neurons, inking motor neurons, and excitatory and inhibitory interneurons.
  • Individual synapses can be modified independently.
Local Protein Synthesis
  • In the early 1980s Oswald Steward, now at the University of California, Irvine, had discovered that even though the vast majority of protein synthesis takes place in the cell body of the neuron, some also occurs locally, at the synapses themselves.
  • The proteins synthesized in the cell body and shipped to the terminals are sufficient to initiate synaptic growth, but to sustain that growth, proteins synthesized locally are necessary.

Memory is far more complicated...

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2022-09-04
Look on Down From the Bridge


Look on down from the bridge
There’s still fountains down there


Look on down from the bridge
It’s still raining, up here


Everybody seems so far away from me
Everybody just wants to be free


Look away from the sky
It’s no different when you’re leaving home


I can’t be the same thing to you now
I’m just gone, just gone


How could I say goodbye
How could I say goodbye


Goodbye


Maybe I’ll just place my hands over you
And close my eyes real tight


There’s a light in your eyes
And you know, yeah, you know


Look on down from the bridge
I’m still waiting for you


I guess it comes down to a simple choice, really, get busy living or get busy dying.
—— Shawshank Redemption

I would like to get busy dying in love.



The Tree on the Hill


ZARATHUSTRA’s eye had perceived that a certain youth avoided him. And as he walked alone one evening over the hills surrounding the town called “The Pied Cow,” behold, there he found the youth sitting leaning against a tree, and gazing with wearied look into the valley. Zarathustra then laid hold of the tree beside which the youth sat, and spoke thus:
 “If I wished to shake this tree with my hands, I should not be able to do so.
 But the wind, which we do not see, troubles and bends it as it lists. We are worst bent and troubled by invisible hands.”
 Then the youth arose disconcerted, and said: “I hear Zarathustra, and just now was I thinking of him!”


Zarathustra answered:
 “Why are you frightened on that account? - But it is the same with man as with the tree.
 The more he seeks to rise into the height and light, the more vigorously do his roots struggle earthward, downward, into the dark and deep - into evil.”
 “Yes, into evil!” cried the youth. “How is it possible that you have discovered my soul?”
 Zarathustra smiled, and said: “Many a soul one can never discover, unless one firsts invents it.”
 “Yes, into evil!” cried the youth once more.
 “You said the truth, Zarathustra. I trust myself no longer since I sought to rise into the height, and nobody trusts me any longer; how does that happen?
 I change too quickly: my today refutes my yesterday. I often overleap the steps when I climb; none of the steps pardons me for it.
 When aloft, I find myself always alone. No one speaks to me; the frost of solitude makes me tremble. What do I seek in the heights?
 My contempt and my longing increase together; the higher I climb, the more do I despise him who climbs. What does he seek in the heights?
 How ashamed I am of my climbing and stumbling! How I mock my violent panting! How I hate him who flies! How tired I am on the height!”


Here the youth was silent. And Zarathustra contemplated the tree beside which they stood, and spoke thus:
 “This tree stands lonely here on the hills; it has grown up high above man and beast.
 And if it wanted to speak, there would be no one who could understand it: so high has it grown.
 Now it waits and waits, - for what does it wait? It dwells too close to the seat of the clouds; it waits - for the lightning?”
 When Zarathustra had said this, the youth called out with violent gestures: “Yes, Zarathustra, you speak the truth. I longed for my destruction, when I wanted to be in the heights, and you are the lightning for which I waited! Behold, what have I been since you have appeared amongst us? It is my envy of you that has destroyed me!” - Thus spoke the youth, and wept bitterly. Zarathustra, however, put his arm about him, and led the youth away with him.


And when they had walked a while together, Zarathustra began to speak thus:
 It rends my heart. Better than your words can express it, your eyes tell me all your danger.
 You are not yet free; you still search for freedom. You are too weary from your search, and too wakeful.
 You aspire to the heights; you thirst for the stars. But your evil impulses also thirst for freedom.
 Your wild dogs want freedom; they bark for joy in their cellar when your spirit trys to open all prison doors.
 To me you are still a prisoner who seeks his freedom: ah! in such prisoners the soul becomes clever, but also deceitful and wicked.
 And the liberated spirit must still purify himself. Much of the prison and the mould still remains in him: his eye has still to become pure.
 Yes, I know your danger. But by my love and hope I beseech you: do not throw away your love and hope!


 You still feel noble, and others still feel your nobility, though they bear you a grudge and cast evil glances. Know that the noble one stands in everyones way.
 To the good, also, a noble one stands in the way: and even when they call him a good man, they want to push him aside.
 The noble man would create the new, and a new virtue. The good want the old, and that the old should be preserved.
 But it is not the danger of the noble man that he might become one of the good, but that he might become a blusterer, a scoffer, or a destroyer.
 Ah! I have known noble ones who lost their highest hope. And then they slandered all high hopes.
 Then they lived shamelessly in brief pleasures, only lived from day to day.
 “Spirit too is lust,” - they said. The wings of their spirit are broken; and now their spirit crawls about, and defiles what it gnaws.
 Once they thought of becoming heroes; now they are libertines. The idea of the hero offends and troubles them.
 But by my love and hope I beseech you: do not throw away the hero in your soul! Keep sacred your highest hope! -


Thus spoke Zarathustra.


ーー「Thus Spoke Zarathustra」, Chapter 8

The youth want to find his personal meanings.
To be a hero in love. Keep sacred his highest hope.


To be a Hero or a part of Christ?
Be a Gambler and take the adventure. Get busy dying in love.

山上的树


  查拉斯图拉发现一个少年总是回避他。某晚,他往彩牛城边的高山上去散步,吓,他看见这少年靠着树坐着,疲乏的目光望着深谷。查拉斯图拉抱着这少年倚坐的那棵树说:
  “如果我想用手去摇撼这棵树,我不能够。
  但是,我们不能看见的风,却随意地摇撼它弯屈它。同样地,我们也被不能看见的手所弯屈所摇撼。”
  这少年突然地立起,他说:“我听到查拉斯图拉说话了,我正想着他!”


  查拉斯图拉答:
  “你为什么惊怕呢?——人与树是一样的。
  他越想向光明的高处生长,他的根便越深深地伸入土里,黑暗的深处去,——伸入恶里去。”
  “是的,伸入恶里去!”少年喊叫起来。“你如何能够发现我的灵魂呢?”
  查拉斯图拉微笑地说:“许多灵魂,除非先被制造了,是永不会被发现的。”
  “是的,伸入恶里去!”这少年又喊叫起来。
  “你说的全是真理,查拉斯图拉。自从我想升往高处去,我对自己便无信心,也无人信任我;——这是何故呢?轻蔑那想升高的人。他到底想在高处做什么呢?
  我如何地自惭于我的升高与我的碰跌呵!我如何地讥讪我的急喘呵!我如何地恨那飞着的呵!当我在高处我是如何地疲倦呵!”


  于是少年沉默下来。查拉斯图拉看着他俩旁边那棵树如是说:
  “这树独自在山上高大起来;它在人与兽之上成长着。
  如果它想说话,任何人不能了解它,它长得太高了。
  于是它等候着,等候着——等候什么呢?它住得太靠近云座了:它或许等候雷火第一击罢?”
  查拉斯图拉说完以后,这少年作激烈的手势叫道:“是的,查拉斯图拉,你说的全是真理。我之想达到高处,只是渴求我自己的没落,而你便是我等候的雷火之一击!你看我罢,自从你来到这里以后,我成了什么?这是对于你的妒忌杀了我!”——少年如是说,而痛哭起来。查拉斯图拉用臂挽住他的腰,把他牵走。


  他俩并肩地走了几分钟,查拉斯图拉又如是说:
  “我心痛极了。你的目光诉说着你所冒的危险比你的语言还清楚些。
  你还是不自由的;你仍找寻着自由。你的找寻使你如梦游者似地清醒。
  你想往自由的高处去,你的灵魂渴求着星球。但是你的恶劣的本能也热望着自由。
  你的野犬也想解放自己;当你的精神尝试开狱门时,它们在地窖里欢叫着。
  在我看来,你还是一个幻想着自由的囚犯:唉!这种囚犯之灵魂,变成机智的,同时变成狡狯的恶劣的。
  精神自由了的人,还得净化自己。在他心里还有许多禁锢和泥垢;你的眼睛也得变成纯洁的。
  是的,我知道你的危险。但是凭着我的希望,我请求你:莫抛弃你的与你的希望罢!


  你还觉得你自己高贵,便是恨你,用恶意的目光看你的人,也认为你高贵。你得知道:无论何人总把一个高贵的人当成一个阻碍物。
  高贵的人也是善良者之阻碍物:虽然善良者也称他善良,那只是把他丢放在旁边。
  高贵的人想创造新事物与新道德。善良的人们却需要旧事物,保存旧事物。
  高贵的人之危险,不是他会变成善良者,而是他会变成无耻者,讥讪者,破坏者。
  唉!我曾知道许多高贵的人,失去了他们最高的希望。于是他们毁谤一切高贵的希望。
  于是他们无耻地生活于短促的快乐上,他们没有隔夜的计划。
  ‘精神也是一种淫乐。’——他们如是说。于是他们的精神自折断了翼:他们现在爬着,弄脏一切他们咬吃之物。
  从前他们想成英雄;现在他们仅是享乐者。英雄这观念使他们痛苦惧怕。
  但是凭着我的希望,我请求你:莫抛弃你灵魂里的英雄罢!神圣化你最高的希望罢!”


  查拉斯图拉如是说。


ーー《查拉斯图拉如是说》,第一卷

保罗灵魂里的英雄 =>


我已经和基督同钉了十字架;现在活着的、不再是我了,乃是基督在我里面活着。我如今在肉身上活的、乃是在于信上帝的儿子而活的;他爱了我,为我舍弃自己。
(加拉太书 2:20 吕振中)

お待ちくださいませ。


一幅痛苦、一幅可怕的景象浮现在我面前:我揭开了人之败坏的幕帘。在我的口中,败坏这个词至少排除了这样一种疑惑:它包含了某种对人的道德谴责。败坏的意思——我想再次强调一遍——是非道德化的:这种非道德化到了这种程度,以至于在迄今为止人们最有意识地追求“德性”和“神性”的地方,我却恰恰强烈地感受到了那种败坏。人们或许已经猜到,我在颓废的意义上来理解败坏:我的看法是,人类现在用来概括最高愿望的一切价值都是颓废的价值
倘若一个动物、一个物种、一个个体丧失其本能,倘若它们选择、偏爱那些对自己有害的东西,那么我就称其为败坏。一个关于“更高情感”和“人类理想”的历史——我有可能不得不讲述这个历史——几乎就是在说明,人为什么如此败坏。在我看来,生命本身就是追求力量增长、追求力量持存、追求力量积累、追求权力的本能:只要没有权力意志,那就只有衰亡。我的看法是,人类的一切最高价值都缺乏这种意志——衰亡的价值、虚无主义的价值以最神圣的名义占据统治地位。
ーー《敌基督者》,6

如果说我对这位伟大的象征主义者有什么理解,那就是:他仅仅把“内心”的实在当成实在,当成“真理”——他把其余的东西,把一切自然、时间、空间、历史之物都仅仅理解为象征,理解为隐喻的契机。
ーー《敌基督者》,34

面对着如同死去般的痛苦和虚空;敢于冒死,行动起来;去迎接久远的安息吧,直到世界末日。
勇敢的冒险者所拥有的从死里复活之意志:真正的坚强是勇敢如爱如死之坚强。冒险者有多么强烈的冒死意志,就有多么强壮。


This is what the LORD says: “Only if the heavens above can be measured and the foundations of the earth below be searched out will I reject all the descendants of Israel because of all they have done,” declares the LORD.


(Jeremiah 31:37 NIV)

耶和华这样说:
『人若能量度在上的诸天,
测透地下面的根基,
我也就会因以色列后裔所作的一切,
弃绝他们众人。』
这是耶和华的宣告。


(耶利米书 31:37 新译本)

“The days are coming,” declares the LORD , “when this city will be rebuilt for me from the Tower of Hananel to the Corner Gate. The measuring line will stretch from there straight to the hill of Gareb and then turn to Goah. The whole valley where dead bodies and ashes are thrown, and all the terraces out to the Kidron Valley on the east as far as the corner of the Horse Gate, will be holy to the LORD . The city will never again be uprooted or demolished.”


(Jeremiah 31:38-40 NIV)

『看哪!日子快到(这是耶和华的宣告),这城从哈楠业城楼直到角门,必为耶和华重建起来。量度的准绳还要往外量,直到迦立山,绕到歌亚。抛尸和倒灰的整个山谷,以及从汲沦溪直到东边马门拐角一带所有的墓地,都必归耶和华为圣,永远不再拔出,不再倾覆。』


(耶利米书 31:38-40 新译本)

Gamble well in love. Prepare for the worst, make bold choices and embark on adventures with the strongest determination. Go outward to the farthest, inward to the deepest, in pursuit of the ultimate facts.

好好地赌博吧。做最坏的打算、怀着最坚定的决心,勇敢地做出选择、踏上冒险旅程。向外往最远处去、向内往最深处去,追求终极真实。

良く賭けましょう。最悪の事態に備え、強い決意を持ち、大胆な選択をして、冒険に出かけましょう。外側に最も遠いところに、内側に最も深いところに、究極の真実を追い求めてください。


上帝说:『我们要造人,按着我们的形像,照我们的样式来造;让他们管理海里的鱼、空中的飞鸟,也管理牲口、以及全地、和爬在地上的各样爬行动物。』上帝就按自己的形像创造人:按上帝的形像创造他:创造他们有男有女。上帝就给他们祝福说:『要繁殖增多,充满全地,去征服它;也要管理海里的鱼、空中的飞鸟、和在地上行动的各样活物。』
(创世记 1:26-28 吕振中)

第六日,让我们恢复创造力。创造更有爱的自己。追求终极真实。


We can be both of God and the devil. Since we’re trying to raise the dead against the stream of time.
ーー Vermouth, Detective Conan

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2022-08-20
枯れない花

The Blood of Lambs: A Former Terrorist’s Memoir of Death and Redemption, Kamal Saleem.


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枯れない花

心に 小さな花が 咲いてる
こころに ちいさなはなが さいてる
心中盛开着一朵小小的花。
君から もらった 枯れない花が
きみから もらった かれないはなが
是你给我的永不凋谢的花朵。
信じることを もう 怖がらないくらい
しんじることを もう こわがらないくらい
已经不怎么害怕自己所相信的,
强くなれたから
つよくなれたから
因为我变得坚强了。
君に逢えて うれしかった
きみにあえて うれしかった
能遇见你,我很高兴。
つないだ手が 夸りだった
つないだてが ほこりだった
能牵着手,是我的荣幸。
今は 别々の空 见上げていても
いまは べつべつのそら みあげていても
尽管我们现在正仰望着不同的天空。
ほら 歩ける ひとりでも
ほら あるける ひとりでも
我一个人也能继续走下去。
悲しい時ほど 笑う私を
かなしいときほど わらうわたしを
在悲伤的时候却仍然绽放笑容的我
何にも 言わないで 抱いてくれたね
なんにも いわないで だいてくれたね
一言不发地被你抱住了。
冻りついたドアが そっと开くような
こおりついたドアが そっとひらくような
仿佛冰冻的门扉渐渐地融化。
そんな気がしたよ
そんなきがしたよ
我有这样的感觉。
君に逢えてうれしかった
きみにあえてうれしかった
能与你相遇我真的很高兴。
孤独さえも 分かち合えた
こどくさえも わかちあえた
连孤独都能一起分享。
今も この空の下 つながっていると
いまも このそらのした つながっていると
现在,我们仍在这片天空下紧紧相连。
そう思える 离れても
そうおもえる はなれても
是的,我仍这样认为,即便是分离两地。
「ありがとう。」も 言えなかった
「ありがとう。」も いえなかった
还没能说出感谢的话语。
约束さえ できなかった
やくそくさえ できなかった
甚至连约定也没有做出。
だけど あの日と 同じ风がふいたら
だけど あのひと おなじかぜがふいたら
但我仍相信,当被和那天一样的风吹拂的时候,
また 必ず 逢えるよね
また かならず あえるよね
我们一定可以再度相见。
君に 逢えて うれしかった
きみに あえて うれしかった
能与你相遇我真的很高兴。
つないだ手が 夸りだった
つないだてが ほこりだった
能与你牵手是我的骄傲。
今は 别々の空 见上げていても
いまは べつべつのそら みあげていても
尽管我们现在正仰望着不同的天空。
ほら 歩ける ひとりでも
ほら あるける ひとりでも
我一个人也能继续走下去。
A small flower is blooming inside my heart,
The undying flower you gave to me,
I was able to believe strongly enough in myself,
So I’m not afraid anymore…

※ I was happy meeting you,
And proud of our holding hands,
Even though we look up to different skies now,
See? I can walk on my own now…

I laugh more during sad times,
To hide the pain I feel inside,
But you hugged me gently without saying a thing
I felt as if it were like opening a door frozen in ice…

I was happy meeting you,
Even though I could only share my loneliness,
Even though we’re separated now,
I still feel that we’re somehow connected under this sky…

I didn’t say thank you…
I couldn’t even promise…
However, like on that day, if the wind blows
Then I know we will surely meet again…

(Repeat ※)
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2022-07-27
生物伦理学基础

第4章 生物伦理学基础

伦理学领域可以为个人提供工具来决定以道德和社会价值的方式行事意味着什么。通过从道德的角度看待行为,道德可以帮助我们在相互冲突的选择之间做出决定。在本章中,我们描述了一些最近的说明性例子,其中伦理问题已经对合成生物学领域产生影响,然后我们将这些问题提出的主题与一些 BioBuilder 活动联系起来。

FIGURE

什么是“好工作”?

想象一个研究人员在实验室工作台上努力工作。在你的想象中,那个研究人员可能穿着一件亮白色的实验室外套,手里拿着一个吸管。实验室本身可能装满了玻璃器皿和设备,用于混合、分离、生长或测量东西。也许有一群人在这个想象中的实验室里一起交谈,或者也许一位研究人员正独自一人在明亮的窗户前工作。

从这个想象中的实验室环境中,你能看出研究人员是否在做“好工作”吗?尽管在这个想象的环境中你可能已经想到了令人印象深刻的细节水平,但表面的线索并不能告诉你很多关于努力的无形品质。你不能仅仅因为想象中的研究人员在微笑,或者因为实验室的墙上挂着奖品,桌子上放着一堆已发表的文章,就判断它是好工作。这些线索可能表明一个快乐的、被认可的、知情的人正在做这项工作,但仅凭这些线索并不能反映工作本身的价值。那么,什么能保证工作就是好工作呢?这个问题出人意料地复杂且难以回答。

麻省理工学院语言学名誉教授诺姆乔姆斯基说,追求个人承诺和关注的机会是生活中最令人满意的事情之一。他建议令人满意的工作是在创造你重视的东西和解决难题中找到,并且这个公式对于研究科学家和木匠一样适用。那么,“好工作”的一个方面可能是拥有一份令人满意的工作,提供资源和机会来为重要的问题寻求具有挑战性和创造性的解决方案。但是,即使你找到了一份创造性的工作,可以让你独立思考一个具有挑战性的问题,你也可能无法保证自己完全满意。对于大多数人来说,好的工作包括为他们面临的挑战提出高质量的答案。我们中很少有人会发现为优秀的问题找到糟糕的解决方案是非常令人满意的——即使我们这样做的报酬很高。

FIGURE

因此,好的工作必须引人入胜且出色——它还必须符合道德规范。 道德指导我们确定什么是对什么是错,作为决定如何采取行动的基础,但并不是每个人都同意什么构成道德行为。更重要的是,一个人对道德行为的定义会随着时间而改变。由于这些原因,社会以持续和动态的方式与道德作斗争。生物伦理学领域有着悠久而丰富的历史,为当前的生物伦理学问题提供了概念基础。技术会发生变化,但生物伦理学的某些核心原则往往会保持相关性。例如,道德决策体现了对个人的尊重和负责任的管理,最大限度地减少伤害,同时最大限度地提高利益,并考虑自由、公平和正义的问题。在本章后面,我们将在几个真实世界的例子中探讨这些核心原则。正如您将看到的那样,道德是定义科学和工程中良好工作的基本要素,其结果不会在实验室工作台上结束。

FIGURE

合成生物学利用科学和工程来应对现实世界的挑战。不可避免地,这些技术解决方案将被一个充满相互冲突的想法和优先事项的社会考虑。进行合成生物学研究的个人也将面临复杂的,有时是相互矛盾的义务。例如,工程师对社会、对客户和对他们的职业负有义务。

今天出现的许多关于合成生物学的问题也出现在 1970 年代,随着重组 DNA (rDNA) 技术的出现。为了为我们讨论合成生物学伦理提供背景,我们将首先考虑 1976 年的一个历史例子,当时 rDNA 技术首次在马萨诸塞州剑桥的哈佛大学和麻省理工学院的实验室中使用。剑桥居民和当地民选官员举行了听证会,讨论与这种新基因工程技术相关的风险。他们最终在评估风险时暂停了半年的研究。当暂停解除后,研究被允许在包括大学官员和当地公民在内的监管委员会的指导下继续进行。这些听证会上提出的担忧在许多关于新兴技术的现代讨论中得到了回应,并继续提供有价值的见解。

FIGURE

在本章中,我们还考虑了在合成生物学这一年轻领域的特定项目中出现的一些伦理问题。毫无疑问,在不久的将来会有新的例子需要考虑。尽管如此,这里列出的例子为该领域的一些伦理复杂性提供了一个起点。它们反映了常见的道德问题,并揭示了广泛适用于新兴技术的指导道德原则。最后,我们重点介绍了 BioBuilder 活动和资源可用于直接解决这些问题的一些方法。

规范伦理研究

合成生物学有可能对人们的生活和整个地球产生持久的影响。然而,与任何新兴技术一样,将承诺与危险区分开来并不总是那么容易。每个合成生物学项目构想都必须考虑其优点和风险。在一定程度上,科学家可以根据个人喜好选择从事哪些项目,但科学研究从来不存在于真空中。资金、政府法规和企业利益都指导着研究的方向——它的目标、应用和局限。

合成生物学的未来取决于研究人员、政府和所有生活将受到影响的人之间的有意义的对话

这次谈话的一个里程碑发生在 2010 年,当时美国总统巴拉克·奥巴马 (Barack Obama) 委托他的一个咨询小组,即总统生物伦理问题研究委员会,研究和报告合成生物学。这个请求是为了回应发表的声明,即他们通过将合成衍生的基因组插入宿主细胞来“创造生命”——我们稍后会更详细地详细介绍这个例子。尽管当时的一些新闻报道将文特尔的科学进步等同于科学怪人式的复活,但委员会更广泛地研究了合成生物学领域,并得出结论认为,从零开始制造新生命形式的能力并不在手。他们对该领域的分析导致了 18 项政策建议,但没有针对合成生物学研究的新规定。该委员会指出,合成生物学的潜在好处在很大程度上超过了主要风险。然而,他们确实警告说,未来可能会出现危险,并建议通过持续的联邦监督“保持警惕”。

合成生物学并不是第一个接受政府审查的生物技术领域。随着分子生物学的出现,类似的讨论发生在 1970 年代。当时的讨论产生了至今仍适用于合成和 rDNA 工作的指导方针。制定这些指南的一个重要方面是进行研究的科学家发起了对话。对他们来说,做好和合乎道德的工作意味着公开询问有关他们实验室和同事实验室正在进行的研究的难题。

科学进步引发伦理问题

在 1970 年代,几个实验室发现了人工组合来自不同生物体的 DNA 并在活细胞中表达这些组合的方法。例如,斯坦福大学的 Paul Berg 博士发现了使用改良猴肿瘤病毒将新基因整合到细菌中的方法。然而,他的成功给他自己和其他人带来了一些重要的担忧。如果科学家使用这些技术改造细菌,然后不小心摄入了一些转化细胞怎么办? rDNA 能否从一个细菌细胞转移到人肠道中的其他细菌?如果 DNA 功能齐全,猴肿瘤病毒会引起感染吗?

在评估这些风险和问题之前,在 1970 年代从事 rDNA 研究的科学家采取了预防措施,并自愿决定暂停任何涉及 rDNA 和动物病毒的进一步工作,直到风险得到更好的了解。暂停研究活动是通过一组科学家写给美国国家科学院的一封关注信发起的,其中包括美国国立卫生研究院 (NIH) 的研究员 Maxine Singer 博士。有关科学家要求学院成立一个委员会来考虑该技术的安全性。 Berg 是 rDNA 技术的早期先驱,他担任委员会主席,负责考虑 rDNA 技术支持的正在进行的研究活动的安全性。委员会得出的结论是,该技术的“潜在风险而非已证明的风险”足以促使人们自愿暂停 rDNA 实验。他们停止了使用新型抗生素抗性基因、毒素编码基因或动物病毒 DNA 制造质粒的实验。尽管暂停是自愿的,但由于委员会成员的权威,该请求在科学界具有重要意义,其中包括与伯格共同获得诺贝尔化学奖的赫伯特·博耶和斯坦利·科恩,以及与伯格共同获得诺贝尔化学奖的詹姆斯·沃森。 DNA双螺旋结构的发现者。

在暂停期间,科学家和政策制定者共同确定风险并制定安全开展研究的策略。著名的科学家们在加利福尼亚州蒙特雷郊外的 Asilomar 会议场地召开会议,为 NIH 准备建议,这些指导方针演变成当前的生物安全水平,至今仍用于描述和包含最危险的实验。

公众回应

许多研究人员将 Asilomar 会议的成果视为一项重大成功,这将有助于确保安全和负责任的研究。然而,暂停引起的关注也有一些意想不到的副作用,包括引发科学界内外对这项研究的担忧。当时,公众对科学研究的大部分注意力都集中在军事实验和引领原子时代的物理学进步上。在 Asilomar 之前,与生物学相关的风险并没有受到太多公众的关注。 通过阐明他们对 rDNA 研究的具体担忧并主张暂停这项工作,生物学家引起了相当多的关注并引发了一场公开辩论

1976 年马萨诸塞州剑桥市议会听证会生动地说明了公众对 rDNA 研究的反应。当时的剑桥市长阿尔弗雷德·维卢奇(Alfred Velluci)得知哈佛大学正计划在美国国立卫生研究院(NIH)发布此类研究的指导方针后立即为高风险 rDNA 研究建立一个特殊实验室而感到沮丧。质疑这个实验室对他的城市及其选民意味着什么,市长 Velluci 召集了剑桥市议会的公开听证会,要求科学家们就 rDNA 及其相关风险作证。公职人员和科学家之间的交流引起了相关人员的担忧和愤怒。 许多问题都与处于起步阶段的任何技术相关,包括合成生物学。本章稍后将探讨三个具体问题——风险评估、自我监管和忧虑,听证会的完整视频记录了科学能力发生变化时出现的其他复杂的公民问题。

FIGURE

风险评估:最大限度地减少伤害,同时最大限度地提高利益

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伦理指导我们权衡一项行动的风险与利益,但在剑桥市议会听证会上出现的最复杂的问题之一是评估与 rDNA 研究相关的风险。科学家和市政府官员都倾向于保守立场,但目的不同。市政府官员希望尽量减少对剑桥市民的潜在伤害,这意味着,至少对韦卢奇市长而言,消除所有风险。 “你能绝对 100% 地保证这个实验不会产生任何可能的风险吗?”他问科学家。 “危险风险为零吗?”

FIGURE

另一方面,作证的科学家通过承认他们不能对风险做出如此绝对的主张,传达了他们对新技术的保守观点。由于科学家受过训练以概率而非绝对的方式说话,因此他们很难以韦卢奇市长所寻求的语言类型向市议会传达一定程度的确定性。例如,哈佛大学教授 Mark Ptashne 说:“我相信绝大多数微生物学家的意见是,实际上授权进行的实验没有重大风险……” Ptashne 教授可能有意图的短语像“压倒性多数”和“没有重大风险”这样的强烈同意声明,但市长和市议会成员似乎认为它们没有定论

“现在我知道你不喜欢听到科学家告诉你存在风险,但它们非常低,”Ptashne 教授继续说道。 “这些风险比你每天在街对面所面临的典型风险要少。”事实上,我们在生活中所做的几乎所有事情都涉及某种风险,在做出决定时,我们会权衡风险与潜在利益,同时尽我们所能将潜在危险降至最低。在我们上街之前看两眼是在进行危险活动时保护自己的一个例子。通过应用 Velluci 市长最初的问题,“你能绝对 100% 确定地保证不会因此而产生任何可能的风险……吗?”对于上班或吃饭等日常活动,答案绝不是明确的“是”。 然而,诚实的风险评估在面对一组新的和未知的潜在危险时可能不会提供太多安慰,例如科学家和公众在 rDNA 实验早期所面临的危险。

自律与政府立法:自由、公平和正义

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在剑桥市议会听证会上,并非所有科学家都同意 rDNA 研究风险低。对一些人来说,阿西洛玛会议的指导方针是有问题的。麻省理工学院教授乔纳森·金和其他人不相信美国国立卫生研究院 (NIH) 等机构可以客观地评估其资助的科学。 “我个人对一个代表美国国立卫生研究院 (National Institutes of Health) 的人来到这里并在继续进行的情况下发表他们的演讲感到非常沮丧,”他说。 “我不认为这些指导方针是由一群代表公众及其所有利益的人编写的……他们是做实验的人。没有任何理由相信它是人民的民主代表。这些指南就像让烟草业编写烟草安全指南一样。”

FIGURE

市议会议员大卫克莱姆回应了他的担忧:“这个国家有一个重要原则,即在某些类型的活动中拥有既得利益的人不应该是不仅负责颁布它,而且负责监管它的人。这个国家错过了核研究和原子能委员会的机会,我们将发现自己陷入困境,因为我们允许自己允许一个既得利益机构发起、资助和鼓励研究,但我们假设他们是无偏见的,并且有能力对此进行监管,更重要的是,执行他们的监管。”

然而,对于其他人来说,这些指导方针足以减轻他们的担忧。“我一直很担心,我会继续担心,”Maxine Singer 博士说,他是致美国国家科学院的原始信的作者之一,该信促使了暂停。但是,她继续说道,“我觉得这些 [用于 rDNA 研究的] 指南是对这种担忧的非常负责任的回应。NIH 内部的整个审议过程是一个非常开放的过程。”

FIGURE

自从这些关于 rDNA 研究的对话在 1970 年代举行以来,对话平台发生了巨大变化,但自治与立法之间的紧张关系依然存在。社区健康、个人安全和增强知识等核心价值观仍然必不可少,但通过互联网快速广泛地获取信息已经影响了此类对话的动态。除了类似 Asilomar 的会议和类似剑桥市议会的公开听证会之外,现在还可以通过网站(包括博客和 Twitter 提要)广泛交流想法和信息。然而,无论场地如何,在审慎的监督和扼杀的监督之间找到平衡仍然是围绕新兴技术的道德讨论和每个社区对“好工作”的定义的核心。

忧虑:尊重个人

许多人对新技术的反应,尤其是那些涉及生命科学的技术,内心的不安情绪是不容忽视的。修补 DNA 和构建新的生物体可能会质疑关于生命本质的基本信念。剑桥市议会的成员没有明确表达这种担忧,但有几条评论暗示了哲学上的反对。“我在过去一周提到了科学怪人,有些人认为这完全是一个大笑话,”维卢奇市长说。“这是我描述当众生以一种新的方式组合在一起时会发生什么的方式。这是一个致命的严重问题……如果最坏的情况发生,我们可能会面临一场重大灾难。”议员大卫克莱姆也表达了他对 rDNA 的感受:“无论如何,我认为你没有任何业务要做。但这是我个人的看法。”

这种对当时 rDNA 研究以及现在的合成生物学研究基础的根深蒂固的担忧不容忽视。进行这项工作的科学家可能已经得出结论,修改自然发生的遗传物质本身并没有错,但他们必须承认,他们的工作受到周围社会的影响并影响着他们。在某个领域拥有独特的专业知识会带来独特的责任,包括持续的风险评估和沟通。即使科学家对他们的风险评估有合理的信心,新的数据或环境也可能随着时间的推移改变这种评估。在社会背景下关注科学的部分中介绍了合成生物学案例研究。

三个合成生物学案例研究

开展安全 rDNA 研究的实验室政策不再在公共论坛上进行激烈辩论,但围绕合成生物学研究的现代对话与过去提出的一些担忧相呼应。此处详细介绍了与合成生物学研究相关的三个项目。每一个都引起了公众的关注和审查。这些例子突出了不同的生物伦理问题。每个例子都非常适合本章稍后描述的生物伦理学活动。

种植你自己的发光植物

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“如果我们用树木而不是电动路灯来照亮街道会怎样?”在 2013 年将 Glowing Plant 项目的介绍视频发布到 Kickstarter 网站时,该项目的开发者提议对植物进行基因工程以产生光。他们的项目受到了其他自然产生光的生物的启发,例如萤火虫、水母和某些细菌。Glowing Plant 的开发人员选择使用编码荧光素酶的基因,这是一种来自萤火虫的酶,可从其化学底物荧光素中产生可见的光芒。他们还选择与拟南芥植物合作,这是一种广泛用于学术和工业研究的常见实验室生物。开发人员制作的关于该项目的介绍视频将他们将荧光素酶插入拟南芥中描述为“未来的象征,可持续性的象征”。许多人一致认为该项目是一项值得努力的项目:Glowing Plant 开发团队通过 Kickstarter 网站上的筹款活动从 8,433 名支持者那里获得了 484,013 美元的众包资金。

尽管高调的言辞和该项目的众多支持者,批评者表达了他们对该项目的安全和道德的担忧,公开询问它是否受到适当的监管。几十年来,转基因作物一直存在争议,人们担心食用此类产品的安全性、潜在的环境和生态影响以及有时围绕使用此类作物的限制性商业行为。抗议者询问如果发光植物种子“逃逸”到野外,可能会成为入侵物种或破坏自然发生的生态系统,会发生什么情况。值得称赞的是,领导该项目的研究人员甚至在项目的早期阶段就预料到了这些问题。例如,其中一位研究人员告诉《自然》杂志,他们可能会使用需要营养补充剂的植物版本,这将减少不受控制的传播的可能性。然而,这种保证并不足以减轻对该项目的所有担忧。What a Colorful World 一章更广泛地考虑了基盘安全性。

围绕该项目的“自己动手”精神产生了第二个担忧。这种发光的植物是由不隶属于大学的个人开发的。该组织隶属于“生物黑客”空间,而不是传统且高度监管的学术或工业研究实验室。尽管至少有一个项目负责人是训练有素的科学家,但至少来自 Glowing Plant 团队的部分外卖信息似乎是,“任何人都可以做到这一点。”确实该项目的一个既定目标是展示合成生物学的前景如何触手可及,这引发了关于应如何决定应开发和部署哪些技术的问题。他们的介绍视频将他们的作品称为“激励他人创造新生物的象征”。尽管合成生物学在新生物的广泛工程中的潜力被一些人认为是赋权且充满机会,但其他人认为合成生物学提供了一些基本工具来造成相当大的伤害,而发光植物项目为新能力提供了早期测试案例在公民科学中。

因为像发光植物项目这样的生物工程项目处于大多数已建立的监管机构的夹缝中,生物黑客的努力已经引发了关于如何保持该领域的邀请和民主性质,同时确保适当的预防措施和监管的重要讨论。保持监督。现有的法律法规没有预料到很多人有能力实践生物技术。尽管可能很难想象发光植物会造成任何严重伤害,但合成生物学的工具和目标仍在不断突破可能的界限。因此,对于合成生物学研究人员而言,重要的是要考虑早期测试案例(例如发光植物)所带来的伦理问题,以预测未来的监管需求,并确保该领域继续朝着促进“良好工作”的方向发展。

“创造”基因组

由于改进了 DNA 操作工具,合成生物学实验室可以致力于构建新的生命系统,例如前面提到的发光植物或产生特定药物化合物或生物燃料的特殊微生物。改进的工具还开辟了其他可能性,包括新的努力从头开始编写整个基因组。随着越来越容易和速度越来越快,合成生物学家可以使用数字序列数据而不是物理模板来合成实验室中任何生物体的基因组 DNA。合成生物学基础章节提供了有关测序和合成技术的更多详细信息。

随着研究人员开始收集大量基因组测序数据,开放共享 DNA 序列数据在 1990 年代后期变得司空见惯。很明显,研究人员囤积他们的序列信息效率低下,而且浪费时间和资源。解决方案是创建公开可用的数据库来存储信息。这样,任何有互联网连接的人都可以访问各种生物的序列数据。 DNA 序列信息可公开用于许多植物和动物物种、常用的耐药基因和人类病原体

基于所有这些可用的遗传数据,理论上,研究人员可以构建可以从头开始编码新生物的合成基因组。但是,尽管好莱坞的侏罗纪公园可能会提出什么建议,但目前成功重建生物体所需的远不止遗传物质。尽管如此,从基因数据中召唤生命的可能性既令人兴奋又令人担忧。许多生物体和病原体的 DNA 序列信息是公开的,基本的 DNA 合成技术使任何负担得起的人都可以编写遗传密码。将这项技术用于善恶的潜力是显而易见的。一些人担心恐怖分子会通过合成一种已被根除或高度遏制的病原体来释放毁灭性的生物武器。其他人则看到了复活灭绝物种和增强地球生物多样性的潜力。所有这些可能的应用都提出了许多额外的伦理、生态和社会学问题。例如,是否应该以任何方式规范对基因组合成器的数字序列信息的访问?对于某些涉及 DNA 合成的实验,是否应该要求研究人员获得额外的安全和伦理批准?复活已灭绝的物种可能带来什么生态后果?

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尽管研究人员目前还远远不能仅从遗传信息中生成复杂的生物体——或者,就此而言,甚至无法将这些生物体的基因组 DNA 拼接在一起——有几个成功合成病毒基因组的实例,这些微观病原体相对于那些自由生活的生物体更简单的遗传学和结构使之成为可能。病毒本质上是被蛋白质外壳包围的遗传物质包。病毒基因组通过劫持宿主细胞的合成机器来运作,指示它产生更多的病毒 DNA 和蛋白质拷贝。换句话说,研究人员可以通过化学合成 DNA 并将合成的病毒基因组通过宿主细胞来产生功能性病毒。

这种应用的一个早期例子出现在 2002 年,当时纽约州立大学石溪分校的科学家从合成产生的短 DNA 片段重组了脊髓灰质炎病毒的基因组,并表明它们可以产生活性病毒。拼凑从 DNA 合成公司购买的短片段需要大量专业知识,但在该项目完成后的几年中,合成技术得到了改进,能够生产更长的 DNA 片段并减少完成所需的技能和工作量这种工作。2002 年的脊髓灰质炎病毒工作是在受监管的安全实验室环境中安全进行的,但相对容易想象,在不同环境中工作的其他人如何以不同的目标危险地应用该技术

基因组合成项目也已经从病毒扩展到更复杂的、自由生活的细菌细胞。2010 年,J. Craig Venter 研究所的研究人员表明,他们可以合成细菌基因组,就像病毒基因组一样,可以劫持细菌宿主细胞的活动。Venter 小组通过从一家 DNA 合成公司订购 DNA 短片段,然后在实验室将这些片段组装成完整的基因组,化学合成了蕈状支原体基因组。他们添加了一些可检测的“水印”,以便将合成的 DNA 与山羊支原体宿主的基因组区分开来。合成的蕈状支原体基因组成功构建并插入山羊支原体宿主细胞,最终用合成基因组编码的蛋白质和宿主物种的独特蛋白质和其他成分取代。重要的是,供体和宿主物种都来自同一个属,支原体。这种对供体和宿主之间密切关系的要求说明了对这类工作的一个限制。尽管如此,**研究人员基本上将 M. capricolum 转化为不同的物种,M. mycoides,只靠 DNA **。

甚至在文特尔的工作之前,研究人员和公众就一直关注许多生物体 DNA 序列数据的公开可用性以及 DNA 合成技术的日益普及。2011 年,两个实验室开发了 H5N1 禽流感的突变株,公共遗传信息库的开放性也受到了审查。他们独立发现的突变使病毒比天然菌株更容易在哺乳动物之间传播。当研究结果公布时,专家们对是否应该公布突变病毒的序列存在分歧。一些人认为,遗传数据可以为病毒传播提供有价值的见解,因此应该共享。其他人担心生物恐怖分子或其他不良行为者可能会利用这些信息来制造一种高毒性、高传染性的人类流感。经过多次辩论和出版延迟,世界卫生组织得出结论认为应该公布这些序列。这种困境无疑将再次浮出水面,因为可以更容易地从数字和公开可用的信息而不是任何有形的起始材料开始制作物理 DNA 序列。

另一种限制病原体合成的方法是监管 DNA 合成公司本身。然而,这些公司分散在全球各地,这使得法规的授权和执行成为一项挑战。相反,许多 DNA 合成公司自愿参与安全协议,以筛选所有订单并质疑合成与已知病原体相似的 DNA 的任何请求,然后再决定是否履行它们。

DNA 合成公司遵循的自愿行为准则可能会阻止一些恶毒的人,但它并非万无一失。2006 年,英国报纸《卫报》通过为高度管制的天花病毒订购略微修改的 DNA 序列,说明了系统中的一个漏洞。《卫报》的记者在保存基因序列信息的众多公共存储库之一中发现了该病毒的完整 DNA 序列,他们下令合成 DNA 片段并将其交付给他们的新闻编辑室。因此,尽管除了两个已知且高度控制的实验室外,其他所有实验室都已根除物理病毒,但记者们还是能够获得编码致命天花病毒的遗传物质。这个新闻报道提高了人们对 DNA 合成行业的认识,但并未在生物安全问题上取得显着进展。保持适当的平衡以确保合成技术和序列信息足够安全以阻止作恶者,但出于正当的研究原因也可以访问,例如学术和工业研究人员从剧毒病原体中订购序列以开发疫苗,这仍然具有挑战性或其他针对他们的治疗。

生物合成药物与公共利益经济学

合成生物学最早的成功之一是由合成生物学公司 Amyris 微生物生产青蒿酸——抗疟药青蒿素的一种有价值的前体。自从发现其抗疟特性以来,青蒿素的需求量一直很大,但生产起来也有些困难。历史上,它是从天然产生青蒿素的中国艾草植物青蒿中提取的,但农民一直难以为这一过程提供稳定的叶子供应,导致供应和价格大幅波动。相信可靠的青蒿素来源可以稳定药物的市场价格并更好地满足需求,加州大学伯克利分校的 Jay Keasling 教授和他的实验室致力于合成青蒿素。使用合成生物学中的许多基础技术以及代谢工程领域的成熟工具,该实验室能够设计出能够产生药物前体的细菌和酵母菌株。终于,在生产公司 Amyris 成立十年后的 2013 年,合成青蒿素的大规模工业化生产开始了。

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一些人称赞这一成功是合成生物学可以做的好事的一个例子。不过,其他人表达了对这项工作的社会和经济影响的担忧,主要是关于它将如何影响迄今为止生产全球青蒿素供应的农民。尽管该合成物经历了过山车式的供应周期,但一些人认为,近年来生产环境可能已经稳定,农民实际上可能有能力适当应对日益增长的药物需求。如果属实,农民可以在不引起药物价格大幅波动的情况下应对供需变化,而合成青蒿素可以被认为是对他们生计的不必要威胁。

还讨论了其他考虑因素。例如,一些人建议,可以腾出不用于种植艾草的农民和土地来种植急需的粮食作物。其他问题仍然存在,即哪种青蒿素生产过程最终会产生最便宜的治疗,或者费用是否甚至是最重要的问题。具体而言,获得治疗可能与其成本一样重要,甚至更重要,除了生产必要的化合物之外,还必须通过基础设施和政策工具来解决获得障碍。

尽管它取得了成功和崇高的使命,但抗疟药物的合成生产并不是一个公开的案例。关于哪种供应来源可以更好地为需要负担得起的稳定治疗的患者和需要谋生的农民提供服务一直存在争议。之前的案例研究主要关注健康、安全和环境健康问题,而这个青蒿素案例说明了合成生物学的应用如何超越科学和医学,进入复杂的世界问题,包括文化和经济。追求或支持任何项目的决定是一个复杂的决定,研究人员、资助机构和消费者都承担着确定什么是“好工作”的责任。

团体生物伦理活动

生物伦理学和生物设计活动有许多相同的挑战和机遇。两者都没有明确的“正确”或“错误”方法,两者都是过程驱动而不是答案驱动。在教授生物伦理学时,我们希望个人:

  • 认识到新进展引起的道德困境。
  • 练习如何倾听和评估不同的观点。
  • 提出解决我们政策或思想差距的行动方案并证明其合理性。有些解决方案对每个人来说都是显而易见的,而其他解决方案将永远存在争议,但教学的最佳点就在那个广阔的中间区域。

在这里,我们提供了一种使用合成生物学来介绍生物伦理学的方法。BioBuilder 内容首先使用 1976 年剑桥市议会关于 rRNA 研究的听证会视频对决策制定的困难过程进行建模。不过,该活动可以适用于本章中介绍的任何案例研究或其他真实的案例研究。您可能会在新闻中找到世界上的例子。您可以通过 BioBuilder Bioethics 在线材料找到更详细的其他活动,其中包括学习目标和评估指南。另一个极好的资源是 NIH 的课程补充“探索生物伦理学”。无论您如何处理这个过程,我们希望这些活动可以鼓励个人提出一些复杂的问题,并接受他们作为专业人士和公民的多重角色。

生物伦理学涉及决策过程

新生物技术的出现,例如 1970 年代的 rDNA 能力和这个时代的合成生物学工具,使我们能够以前所未有的方式改变生命系统。虽然大多数 BioBuilder 活动都涉及如何进行合成生物学,但本节重点关注我们应该如何处理合成生物学。为了回答“应该”而不是“如何”的问题,我们转向伦理领域,它提供了一个就道德复杂问题做出决定的过程。在下一节中,我们将概述一种提出“我们应该”问题的方法。

识别道德问题

伦理为我们提供了一个通过从多个角度仔细考虑问题来解决难题的过程。此过程的第一步是确定特定场景的道德组成部分。“应该”问题是一个标志。例如,“科学家应该建立新的生物吗?”显然是一个生物伦理问题,而“建造新生物安全吗?”是一个科学的。其他类型的问题可能是合法的(“如果我制造了新的生物,我会被罚款或监禁吗?”)或个人喜好问题(“我应该做什么样的研究?”)。区分个人偏好问题和道德问题可能会变得非常棘手,因为它们都可能包含“应该”问题。一个关键区别是决策如何影响其他人。当其他人对结果有利害关系时,问题就变成了道德问题,而不仅仅是偏好问题。

识别利益相关者

在确定问题的核心伦理问题后,下一步涉及确定谁或什么可能受到结果的影响。这些“利益相关者”可以包括政府、学术界、公司、公民或环境等非个人。从多个角度考虑问题是道德决策的一个关键方面。并非总是能够满足所有利益相关者,因此确定谁的利益受到保护是该过程的主要部分。

将事实与指导道德原则联系起来

该过程的下一阶段涉及概述相关事实和指导道德考虑。科学和社会事实对于做出生物伦理决策都很重要。在决定科学家是否应该建造新生物时,重要的是要考虑有关安全的科学事实以及有关特定人群是否可能面临不成比例的风险的社会事实。当有关问题的信息不完整时,可能需要进行额外的研究才能做出明智的决定。或者,决策是基于最佳可用知识做出的,但在新信息出现时具有足够的灵活性以进行更改。相关事实对于特定情况是相当具体的,但指导性的道德考虑往往更广泛适用。它们反映了我们生活的社会类型,或者至少反映了我们向往的社会。指导道德决策的一些共同核心原则包括尊重个人、在最大限度地提高利益的同时最大限度地减少伤害以及公平。我们可能会选择以不同的方式优先考虑这些核心原则或包括其他相关原则,但许多道德决策包含了这些想法中的一个或多个。

最后,是时候根据您考虑的观点做出决定了。在现实世界中,道德不仅仅是思想练习。决策会影响公共政策和法律。毕竟,这些后果是伦理审议的重点。尽管我们很少在社会伦理问题上达成一致,但我们可以使用这个过程来证明我们自己的推理是正确的。

剑桥市议会听证会:行动中的生物伦理学

前马萨诸塞州剑桥市市长 Alfred Velluci 在 1976 年剑桥市议会听证会上告诉召集的科学家小组“不要使用字母表”时,他要求科学家们避免使用行话,但他也提供了一个标语来区分两者。科学与社会。您可以从 MIT 150 网站观看 30 分钟的听证会视频,“假设风险,剑桥市议会关于剑桥 DNA 实验的听证会”。视频中的交流突出了任何新兴技术的许多相关方面,而不仅仅是 rDNA。

在观看视频之前,先回顾一下“重组 DNA”的含义,这是有帮助的,它是从不同的天然或合成来源拼接在一起的 DNA(有关详细解释,请参阅合成生物学基础和 DNA 工程基础章节)和“生物安全水平”,它们是描述包含危险生物材料所需程序的实验室名称(有关此的更多信息,请阅读以下侧边栏以及 NIH 和 BioBuilder 网站上的其他资源)。


生物安全水平

BL4 实验室含有引起危及生命的疾病的最高风险的传染源。BL2 实验室也适用于人体细胞和细胞系。例如,BL1 实验室仅使用经过充分研究的生物体,这些生物体已知不会在健康成人中引起疾病。BL4 实验室是对世界上最危险的病原体(如埃博拉病毒)进行研究的地方。这些实验室拥有专门的设备来物理控制实验并防止病原体扩散到“清洁”区域。美国国立卫生研究院 (NIH) 使用四个生物安全级别对含有危险生物材料的实验室进行分类。当科学家研究可治疗但危险的病原体(例如引起鼠疫、SARS 和西尼罗河脑炎的病毒)时,需要 BL3 实验室。BL1 实验室包括典型的高中和本科教学实验室。BL4 实验室很少见,通常设在孤立的建筑物中以保护邻近社区。在 1970 年代被称为生物危害水平 P1、P2、P3 和 P4 的水平现在被称为生物安全水平 (BSL) 1、2、3、4。BSL1(或 BL1,历史上为 P1)表示包含危险性最低的生物体的实验室和 BL3 实验室的科学家需要使用高度专业化的防护设备和程序。在这些实验室中,科学家根据需要戴上手套、实验室外套和护目镜。 材料,而 BL4 实验室包含最危险的试剂。例如,实验室的空气在排放到室外之前会经过过滤,并且对实验室的整体访问受到严格限制。BL2 实验室适用于研究导致非致命疾病的细菌和病毒,例如莱姆病或沙门氏菌感染。每个级别都指定了将该设置的风险降至最低所需的预防措施和程序。


为了为这里描述的活动奠定基础,想象科学界对重组 DNA 实验的安全性提出担忧三年后。在 NIH 发布规范重组 DNA 工作的指导方针之后一个月。剑桥市议会正在与附近机构的科学家会面,讨论这些指南对实验室周围社区的影响,并考虑该市可能采取的其他决议和行动,以确保其公民的安全。听证会于 1976 年在剑桥市政厅录制,尽管音频和视频质量有所下降,但它为了解这些辩论的动态提供了一个宝贵的窗口,展示了有时回想起来看起来只是学术性的人性的一面辩论或简化为过度情绪化的公众反应。

看完剑桥市议会的录像带后,分发 BioBuilder 网站和本章末尾提供的成绩单副本。以小组的形式回顾角色的演员阵容。然后,分成更小的小组,每组分配一个主要参与者。每个小组都应该指定一个记录者来记录他们的角色如何回应(或没有回应)以下问题:

  • rDNA 实验会产生危险的生物吗?
  • rDNA 实验是否应受 NIH 监管?
  • rDNA 实验是否应受剑桥市议会监管?
  • rDNA 的“常规”实验是否会危及进行实验的研究人员?
  • rDNA 的“常规”实验会危及剑桥市民吗?
  • rDNA 研究有什么好处吗?
  • 剑桥应该允许 rDNA 研究吗?

记录每个角色是否决定,1) rDNA 是否应按照 NIH 已经制定的指导方针继续进行,或者,2) 是否应暂停剑桥市的所有 rDNA 实验,直到发生进一步的调查。

引入利益相关者的概念,即受决策结果影响的人。视频中介绍了哪些利益相关者?一些例子可能包括科学家、公民、民选政府官员、任命政府官员、环保倡导者、学者、渔民等。

为每个角色分配他/她的主要利益相关者角色,然后报告以下问题:

  • 你的角色的主要利益相关者角色是什么?
  • 你们是否都立即同意为您的角色分配哪个利益相关者角色?
  • 您考虑过哪些次要角色?

作为一个小组,回顾利益相关者的角色如何与角色的决定保持一致。一个群体的利益相关者是否都持有相同的观点?使用以下一个或多个焦点主题可以进一步促进讨论:


风险评估

不同的利益相关者如何处理 rDNA 研究的风险评估?

检测和监视威胁

利益相关者的背景知识和经验如何影响他们检测威胁的方式?直接访问和控制潜在威胁如何影响对该威胁的感知?

紧急情况和准备

对紧急情况的合理准备水平是多少?可以做些什么来就罕见但可怕的可能情况的合理准备水平达成一致?如何确定和讨论此类准备的权衡取舍?

话语和修辞

科学家与市议员使用语言的差异如何反映他们的不同观点?仅仅是语言上的不同,还是真正意义上的不同?

自律与政府立法

对于科学界来说,自律与政府立法的优缺点是什么?他们对当地公民有什么不同吗?

科学的过程

科学过程与法律或公民过程有何不同?它们在哪些方面相似?科学过程的迭代性质,其中证据建立但不“证明”一个想法,如何导致期望的差异?更好地理解科学过程是否有助于讨论?如果可能,如何达成共识?


利益相关者活动

在这项活动中,团体或个人站在利益相关者的角度进行生物伦理决策。它可以伴随此处介绍的任何案例研究或您选择的其他案例研究。尽管该活动可以单独开展,但从第 85 页的“剑桥市议会听证会:行动中的生物伦理学”部分开始,介绍了利益相关者的概念,并模拟了道德决策的过程。

回顾一下生物伦理学是一个可以通过提出以下问题来构建的过程的想法:


什么是伦理问题?

道德问题的一个关键特征是其结果会对个人或群体产生负面影响。

相关事实是什么?

考虑科学、社会学、历史和所有其他类型的事实可能很重要。

谁或什么会受到问题解决方式的影响?

这些是利益相关者。把每一个都写在记事卡上分发,这样每个人都被分配了一个。

相关的伦理考虑是什么?

尊重人、减少伤害同时最大化利益以及公平是我们讨论的核心原则,但这份清单绝不是详尽无遗的。


从本章或新闻中选择一个案例研究开始,然后解决前面的关键问题。根据您的设置,提供一个或所有问题的答案可能更合适。对于更高级的小组,一起考虑问题然后集体得出一组答案可能更明智。

接下来,分组并为每个组分配一个利益相关者角色;例如,所有政府官员都属于一组。其他利益相关者角色可能基于与科学、工业、公民社会、政策、教育、艺术或其他领域的联系。就本活动而言,最好将利益相关者的数量限制在四五个,因为这将决定小组的数量。这可以通过消除除最直接受影响的利益相关者之外的所有利益相关者或通过创建更广泛的类别来实现;例如,将民选和任命的政府官员归为一类,或者将消费者、投资者和儿童归为一个“公民”类别。在这些小组中,花时间从利益相关者的角度讨论道德问题。团体应考虑相关事实和道德考虑,例如尊重个人、减少伤害/最大化利益、公平以及可能想到的任何其他内容。每个小组应就利益相关者的首选行动方案和支持理由达成集体决定。

接下来,组将改组,使每个组都有来自每个利益相关者角色的代表;例如,一位政府官员、一位科学家、一位公民和一位企业领导都在一个群体中。在这个混合组中,应该再次讨论伦理问题,从他们指定的利益相关者角色的角度考虑相关事实和伦理考虑。每个小组都应该就首选的行动方案做出决定,但这次做出决定可能需要投票,因为每个人都有不同的观点和利益需要保护。让每个小组的代表与更大的小组分享他们的决定。所有小组都得出了相同的结论吗?

最后,为了将他们的个人想法与利益相关者群体的想法联系起来,个人可以分享或撰写后续声明,描述当从一个统一的利益相关者群体转移到一个混合的群体时,他们的行动或推理过程是否发生了变化。他们的个人观点与其利益相关者身份所表达的观点之间是否存在联系?如果他们最终发现自己从事这些利益相关者的职业之一,他们会看到自己的个人观点发生变化吗?

额外阅读和资源

  • “贝尔蒙特报告”:国家保护生物医学和行为研究人类受试者委员会。(1979) 保护人类研究对象的伦理原则和指南。
  • Berg, P., Singer M. F. 重组 DNA 争议:二十年后。 Proc Natl Acad Sci 美国。1995;92(20): 9011-3。
  • Cello, J., Paul, A.V., Wimmer E. 脊髓灰质炎病毒 cDNA 的化学合成:在没有天然模板的情况下产生传染性病毒。科学 2002; 297(5583): 1016-8。
  • Gibson D. G. 等,创建由化学合成基因组控制的细菌细胞。科学 2010; 329(5987): 52-6。
  • Randerson J. 有人订购天花吗?卫报,2006 年。( http://bit.ly/order_smallpox )。
  • Rogers, M. 潘多拉魔盒大会。滚石 1975;18: 19。
  • 网站:DIYbio 道德规范 ( http://diybio.org/codes/ )。
  • 网站:发光植物・参考资料 ( http://www.glowingplant.com/ )。
  • 网站:MIT 150 网站:“假设风险:剑桥市议会关于重组 DNA 研究的听证会”( http://bit.ly/hypothetical_risk )。
  • 网站:NIH 的“探索生物伦理学”( http://bit.ly/exploring_bioethics )。
  • 网站:NIH 生物安全指南 ( http://bit.ly/biosafety_guidelines )。
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2022-07-26
DNA 工程基础

第3章 DNA 工程基础

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您可用于构建的工具通常会定义工程成果。例如,起重机等新型建筑设备使建造摩天大楼成为可能,不断改进的晶体管使我们的计算机运行得越来越快。在本章中,我们考虑合成生物学的一个关键工具,即 DNA 工程。如果我们希望我们在编写遗传密码方面的流畅度与我们在其他编程语言中的流畅度相匹配,就必须有轻松编写、编译和调试 DNA 代码的方法。在本章中,我们将考虑标准化工程技术如何帮助实现这一目标,以及当前的 DNA 工程工具如何工作并适应该环境。

构建讨论

轻而易举。别紧张。非常简单。

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将“轻松”等同于“快乐”的文化习语无处不在。我们似乎向往一种挑战更少的生活,以及一种一切轻松自如的生活。谁不想这样?然而事实证明,让事情变得简单并不容易。例如,想想无处不在的自动洗碗机设备。据最新统计,大约 85% 的美国家庭都有洗碗机,尽管我们只用双手、一些热水和海绵就可以完成同样的任务。显然,大多数房主认为将叉子扔进机器比用手清洁更容易。

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然而,将洗碗机放入如此多的家庭需要 150 多年的发明时间。洗碗机最初是带有手摇曲柄的木箱,可以通过溅水旋转一排盘子。第一个可靠的省时洗碗机是 Josephine Cochrane 的专利发明,她厌倦了她精美的瓷器因手洗而遭受的损坏。由于 KitchenAid 公司的成立(由同一位发明专利的女性创立)以及现代管道的多次升级,这些电器变得广泛可用。甚至可以说,由于热水器、洗碗皂的发明以及可以为孩子们从洗碗机中清空盘子提供的每周津贴,洗碗变得容易了。从这个例子可以清楚地看出,让事情变得更容易需要付出很多努力,而且通常需要很长时间。

使事情变得简单所涉及的艰苦工作在这里是相关的,因为许多合成生物学家希望使生物学更容易设计。任何在生物研究实验室工作过的人都会告诉你,该领域要实现这一目标还有很长的路要走。让生物学按照我们的意愿行事是一项挑战。在活细胞中,变异比比皆是,我们对细胞的工作原理有很好的了解,但并不完全了解。因此,看似简单的实验如果能够成功完成,通常需要比预期更长的时间来完成。工程师们对这些工作的延误和不可预测性感到沮丧,他们敦促合成生物学对基础构建工具、通用编程语言和制造中心进行长期投资。他们争辩说,我们不可能建造复杂的结构,例如帝国大厦,如果没有起重机,可以举起非常重的物体,没有建筑商可以遵循的蓝图,没有钢铁厂来提供所需的建筑材料,那么如果没有类似的东西,我们怎么能建造复杂的生物学呢?用于设计和构建活细胞的资源?

显而易见的紧张关系是改进工程工具所需的时间和精力与每个人都渴望完成给定工作的渴望之间的关系。我们之前考虑的洗碗机示例说明了具有相同张力的旧案例。据报道,约瑟芬·科克伦(Josephine Cochrane)对制造机械工作版本的机器需要多长时间感到厌恶,因此她于 1866 年自己发明了这台机器。然而,她的第一台洗碗机的成本很高,使其仅适用于诸如此类的商业场所。作为餐厅和酒店。洗碗机成为家居用品需要 50 多年的成本降低和工程改进。

在本章中,我们探讨了合成生物学的一个基本要素,如果生物学工程变得更容易,它必须改进:DNA 工程。我们将专注于标准化作为促进这一过程的一种方法,从更强大的工程学科的历史案例中汲取灵感。我们通过研究克隆和聚合酶链式反应 (PCR) 技术,将这些关于标准化的想法应用到 DNA 工程中,这些技术已经超过了一代人的历史,然后我们将注意力转向了一些更现代的 DNA 序列组装技术。

零件和测量的标准化

标准,例如电源插座的形状和电压(如图 3-1 所示)以及杯子或克的标准量度,通过带来一致性和用于描述的通用词汇使工程和生活变得更容易事物。通过在我们构建或测量时同意某些标准,我们可以确信当我们将它们组合在一起时它们会“匹配”。在没有标准的情况下,我们会遇到令人沮丧的不一致——比如我们为手机或笔记本电脑带错了充电器。


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图 3-1 世界各地电源插座标准的变化。世界各地的电源插座标准各不相同,澳大利亚(左)、意大利(中)和美国(右)要求使用独特的插头。


什么是标准化?

标准化是成熟工程学科的一个关键属性,因为它使工程师能够更快地实施令人兴奋、创新和有用的解决方案。例如,考虑工业革命期间出现的制造装配线。在此之前,大多数产品都是手工制作的,通常由一个人精心制作所有单独的零件并将它们组合在一起。这个过程发生了变化,制造因标准和可互换零件的可用性而发生了革命性的变化。单个零件可以在一个工厂用机器生产,然后在别处组装成各种产品。

突然之间,在一个地方制造的杠杆可以用于制造钟表、缝纫机或火车车厢,从而提高制造效率并加快工程设计周期。毫无疑问,标准化零件的可用性使工程师能够更快地制作新想法的原型。

常见的标准化特征包括组件的尺寸、形状、材料属性和行为。正如乐高积木的巧妙设计所示,这些方面对于正确组装零件非常重要。乐高积木很容易拼合在一起,因为它们都有一定大小和间距的凸块和孔。任何乐高积木顶部的凸块都适合任何其他乐高积木底部的孔,并且这些部件都是由相同的硬塑料制成的,因此它们可以互换并用于构建许多东西。

世界各地的电源插座为零件的组装标准提供了一个有趣的对比。在这种情况下,“组装”是指将设备插入插座。随着时间的推移,世界各国为其电源插座开发了不同的尺寸、形状和电压。因此,为在美国使用而设计的电器不能直接在其他国家使用,因为插头根本无法插入插座。根据这个讨论,你可能会想,“嘿,等一下,如果世界上有各种类型的电源插座,这些东西肯定不是标准化的!”事实是,标准化并不一定意味着就单一标准达成一致。例如,另一个人可以制作类似乐高积木的不同大小或间距的凸块和孔。尽管如此,每个国家(或类似乐高积木的积木制造商)都必须有自己内部一致的标准,但现有的所有部件并不需要普遍可互换。可变性的缺点是零件不再完全可互换。

因此,在实践中,工程师们同意使用有限数量的标准,只要它们可以相互转换并且清楚哪个标准单元用于给定项目,它们就可以很好地工作。正如我们将在下一节中讨论的那样,长度测量为标准的重要性和竞争标准的存在提供了一个很好的例子。

竞争标准

标准可以(而且确实!)来自任何地方。例如,主要在美国使用的“脚”尺寸(图 3-2)最初是基于人脚的大致长度。当然,不同人的脚长差异很大,所以在最初的形式中,这个“我的脚长”标准可能对个人有用,例如建筑商,独自建造房子。但是,如果这个建筑商需要从木匠那里获取材料,如果他的脚和木匠的脚不一样,那么建筑商就有麻烦了。所需的 16 英尺长的木板可能太长或太短,这取决于谁的脚更大。当然,现在我们有一个标准化的英尺测量来消除这种不一致。


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图 3-2 竞争标准示例。我们熟悉的竞争标准的一些示例包括英制与公制长度测量(左)、.tiff 与 .jpg 图像文件(中)以及交流电 (AC) 与直流电 (DC)(右)。


另一种距离标准,米,最初被定义为赤道和北极之间距离的百万分之一。这个距离因人而异,但很难独立测量。如果建造房屋的建造者以米为单位测量材料而不是用脚测量,他无法直接测量从赤道到北极的分数距离,因此他需要一根米尺来估算所有长度,因为木匠会。

英尺和米是长度的替代单位,它们提供了竞争标准的示例,以及每种替代标准的优缺点。脚更直接有用,而米更标准。任何给定的标准都没有“正确”或“错误”之分,只有一个可能或多或少适合特定应用的标准。对于需要木匠提供的木板的建筑商来说,重要的是他们都使用相同的单元,否则原定 16 英尺长的木板可能会到达 16 米。而且现在英尺和米都是标准化的,如果需要,工程师也可以在这两种度量之间进行转换,所以两个标准的存在是可行的。

竞争标准,即使是可互换的标准,也可能导致一些荒谬的解决方法。 例如,1873 年,马萨诸塞州汤顿的 Mason Machine Works 为大西洋、密西西比和俄亥俄铁路制造了一种漂亮的新火车发动机。但是由于铁路的轨距在制造火车的马萨诸塞州和交付火车的俄亥俄州的轨距不同,因此火车无法在马萨诸塞州的轨道上行驶,必须在平地上运送到目的地车。

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这个例子说明了标准单元的明显好处,但在实践中,开发和遵守单一标准对于任何领域来说都是困难的。除了相互竞争的英制和公制测量系统之外,其他历史示例包括用于视频的 Betamax 与 VHS 以及用于电力的交流电与直流电。也许不同的利益相关者有不同的目标或优先事项,这些偏好导致他们提倡一种标准而不是另一种标准。即使是一个优于另一个标准的标准,如果作为替代品进行推广,也会带来技术、实践和心理障碍。

如何建立标准

所有领域都存在如此多的竞争标准的部分原因是标准可能以一种特别的方式出现。单个研究人员或工程师可能会开发适合特定需求的测量或制造实践。然后其他人可能会认为该单元很有用并采用它,也许会稍作修改以使其更适合他们自己的目的。这种类型的有机标准开发可能会很混乱,因为研究人员会根据自己的目的以不同的方式调整单元,在新兴标准中产生细微的变化,但它也可以为实验和优化提供极好的机会。围绕这种非正式开发的“伪标准”逐渐达成共识也可以节省时间和金钱,特别是在容易向意想不到的方向发展的快速变化的领域,使得最终所需的标准在一开始就无法得知。

致力于该领域基础性进展的合成生物学家 Jason Kelly 博士引用了 1858 年铺设的第一条跨大西洋电缆作为特别标准制定的指导性研究。由于跨大西洋电缆必须在水下运行,工程师们面临着测量和维修方面的挑战,这是他们在 1840 年代使用陆地电报线时从未遇到过的挑战。如果固定电话不起作用,则可以对其进行目视检查、测量,然后将其调整为正常运行。海底电缆的维修需要一个不同的计划,因为没有简单的方法可以目视检查它们。相反,工程师们回到了基础。电缆铜线的制造商可以使用各种类型的电池来测量其电气特性以产生标准电压,并使用校准的电流计来记录电流。 测量结果表明,每根电缆的电阻因制造商而异,这并不令人惊讶,因为电缆中的铜最多只有 50% 的纯度。尽管如此,对导电特性的精确测量使得即使是不均匀的铜线单元也可以组装成电缆,可以在 2000 多海里和 12000 英尺的海水下运行。 1858 年电缆铺设成功,维多利亚女王和詹姆斯·布坎南总统在英美之间交换信息所需的时间从几天缩短到几小时。

然而,电报信息在仅仅三周后就结束了,海底电缆的绝缘层出现故障,电缆因无法修复而不得不废弃。然而,随着未来几年技术的改进,后续电缆的故障可以从电缆的岸端追踪。为了粗略地定位故障,电缆制造商依靠他们精确记录的电阻率测量值,然后将维修船派往电路故障的大致位置。定位电报线路中的故障并不依赖于电阻率标准,而是依赖于非均匀电缆的预期行为。

到 1860 年代后期,建议采用统一的电阻标准,以更好地比较每个电缆制造商收集的数据。英国科学促进会制定了一个新的物理参考标准来定义这个新标准。参考对象是黄铜外壳中的铂合金线圈,他们声称它产生了 1 欧姆的电阻。这个定义有点武断——单欧姆的电阻值没有什么神奇之处——但它提供了必要的基准。该参考标准易于复制,因此可以广泛分发给各个电缆制造商,并附有如何使用它测量电阻的说明,如图 3-3 所示。该参考标准使许多制造商更容易测量其电缆的电气特性,并允许在制造商之间对测量结果进行比较。最初的参考欧姆并不是一个完美的标准,它已经随着时间的推移进行了调整。即便如此,标准化的早期努力被证明对海底电报线的具体应用是有用的,它启动了欧姆标准的发展。

这个例子的教训与合成生物学特别相关,合成生物学本身还处于标准化的早期阶段。多年来,世界各地的生物实验室一直在使用各种技术从 DNA 片段构建遗传回路,其中一些将在下一节中描述。然而,合成生物学强调遗传电路的可扩展组装,这需要标准化 DNA 的组装。下一节还描述了一些标准化 DNA 部件组合方式的早期想法和努力。


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图 3-3 定义标准欧姆的参考对象。此图像类似于用于将欧姆定义为电阻测量值的物理参考标准。它包括一个用于进行电阻测量的金属物体及其使用说明。


DNA 工程实践

在介绍了标准化在其他工程领域所扮演的角色之后,我们现在将探讨它如何应用于合成生物学以及合成生物学中主要组成部分的物理组装:DNA。

你可能会想,“生物功能需要这么多重要的分子,比如蛋白质、脂质,以及 DNA 和 RNA——我们不只需要 DNA 来设计生物学吗?”你说得对,DNA 本身是一种惰性分子,只是细胞功能的关键参与者之一,但是由于信息通常从 DNA 流向 RNA 再到蛋白质(称为中心法则的范式),因此对有机体的任何变化 DNA 将影响所有下游功能。正是 DNA 编码的产物,如细胞的酶和结构分子,负责执行使细胞发挥功能的生化功能。归根结底,必须操纵这些功能,这是通过工程 DNA 完成的。换句话说,构建生物系统的部分力量和美妙之处在于,细胞可以仅根据它们所包含的 DNA 序列来改变它们的分子组成。通过这种方式,它们的行为有点像计算机读取软件,只是细胞不是解释零和一,而是读取以 DNA 语言出现的指令。

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DNA 是一个大分子——更具体地说,它是由四种核苷酸结构单元组成的聚合物,它们头尾相连,形成数百万个核苷酸长的链。DNA 遵循与其他分子相同的化学规则,因此合成生物学家可以通过在核苷酸单体之间形成键来从头开始设计 DNA。此外,合成生物学家可以从从生物系统中提取的天然 DNA 中破坏和重建碱基之间的键。最常见的是,合成生物学家结合使用这两种方法将“合成”和天然存在的 DNA 片段组装成新的和所需的遗传回路。为此,工程师们找到了巧妙的方法来选择负责细胞中类似过程的天然存在的酶,以在称为分子克隆的过程中在试管中进行 DNA 工程反应(参见“克隆酶的起源”,第 54 页)。

DNA 组装的最终产物称为重组 DNA (rDNA)。rDNA 是指在实验室用分子克隆技术制成的 DNA。产生的 DNA 可以是自然界中可能出现或不出现的序列的组合。rDNA 比现代合成生物学领域早几十年开发,是合成生物学基础章节中描述的传统分子生物学工具包的一部分。在以下部分中,我们将描述 DNA 操作方法中的一些共同原则。然后,我们探讨了三种采用不同标准化水平的具体方法,每种方法都有自己的优点和缺点。

DNA 组装基础知识

DNA 组装需要一些基本组件和工具:

  • 大量 DNA,编码所需的特定功能
  • 一种精确组合 DNA 片段的方法
  • 一种将这些工程 DNA 成分引入目标生物体的方法

可用于操作 DNA 的方法效率低下,因此通常 DNA 工程师从尽可能多的 DNA 开始,然后选择包含所有所需 DNA 成分的相对稀有的 DNA 组合。有几种不同的方法可以产生大量的初始 DNA,包括 PCR、质粒制备和合成。这些过程在我们继续进行时将更详细地讨论,可以单独使用或组合使用以产生广泛的重组 DNA。

rDNA 通常作为称为质粒的小圆形 DNA 片段通过称为转化的过程引入细胞(见图 3-4)。您可以在多姿多彩的世界一章中阅读更多关于转型过程的信息。基于质粒的 DNA 工程方法的替代方法是直接编辑生物体的基因组,这是可能的,但我们不会在这里讨论。简单的质粒制备方案可以提供所需量的 DNA 作为进一步实验的起始材料。我们可以使用限制性内切酶操作许多市售质粒(参见第 54 页关于“克隆酶的起源”的侧栏)。最低限度,质粒编码一个选择标记,通常是一个赋予药物抗性的标记,以及一个多克隆位点,这是一个包含许多限制性位点的区域,我们可以轻松地插入或移除基因。这样一个最小的质粒可以被纯化,作为一个空白的画布或“骨架”,工程师可以在其中构建新的基因。或者,质粒可能已经包含感兴趣的基因;在这种情况下,质粒被纯化,以便通过几个后续步骤从质粒中提取该基因。在任何一种情况下,质粒制备方法都利用了细胞的自然复制能力,以最少的人力或干预来制作其 DNA 的许多拷贝。因为质粒 DNA 通常比基因组 DNA 更容易操作,所以 rDNA 通常在整个克隆过程中保持质粒形式。


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图 3-4 标准质粒表示。灰色圆圈代表质粒。蓝色箭头代表质粒的功能部分,箭头代表该组件所需的转录方向。 XbaI、SpeI 和 PstI 标记将被相应限制酶切割的位点。


PCR(图 3-5)是另一种生产组装所需 DNA 的常用方法。您可以在合成生物学基础章节中阅读有关 PCR 的更多信息。简而言之,使用 PCR,工程师可以生成许多拷贝的特定 DNA 序列,通常长达几千个核苷酸,以线性形式,从只有很少的拷贝开始。除了所需的 DNA 起始材料(也称为模板 DNA)之外,PCR 还需要引发寡聚体,有时称为“引物”,有时称为“寡聚体”,它们是长度可达约 50 个核苷酸的 DNA 短聚合物。为了进行 PCR,模板 DNA、引发寡聚体、酶和缓冲液被放置在机器中以循环通过不同的温度。通过 PCR 产生的 DNA 可以随后插入到质粒中,从而可以通过如前所述的简单质粒制备来分离 DNA 序列的副本。此外,可以对 PCR 产生的 DNA 进行工程改造,使其包含一些有用的修饰。例如,它可以通过将所需的修饰结合到引发寡聚体中而附加短序列,例如限制性位点。


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图 3-5 聚合酶链式反应。蓝色条代表要扩增的 DNA 序列区域,黑色箭头代表定义该序列边缘的引发寡聚体。


化学 DNA 合成(图 3-6)是另一种生成 DNA 的方法。核苷酸在试管中被一个一个地添加到不断增长的单链 DNA 链中。然而,指导 DNA 的化学合成有几个优点。一方面,核苷酸以化学方式相互连接,无需任何模板 DNA。因此,所需基因可以仅从有关所需序列的数字信息中产生,而不必事先存在于自然界中。化学 DNA 合成的另一个优点是产品的构建是外包的,这使研究人员可以腾出时间专注于其他实验。然而,在这一点上,化学合成最常用于制造用于 PCR 的引发寡聚体。就其本身而言,这种制造 DNA 的方法受到与合成相关的成本、生成产品所需的时间以及对超长序列合成的一些持续技术限制的限制。但是,将短 DNA 序列的化学合成与基于 PCR 的组装方法相结合的混合方法作为获取天然和合成基因的手段正变得越来越普遍。

连接酶封闭了 DNA 中的切口,限制性内切酶破坏了 DNA 磷酸二酯骨架中的键。如图 3-7 所示,取决于酶。限制性内切酶和连接酶是分子和合成生物学家的便捷工具,但如果您好奇它们为什么存在于自然界中,下面的侧边栏会解释克隆酶的起源。质粒制备、PCR 和化学合成都是公认的生成起始材料以组装成 rDNA 的方法。如果用相同的限制酶切割不同的 DNA 片段,得到的末端将是互补的,DNA 片段可以相互连接。为了“剪切”和“粘贴”DNA 起始材料,通常使用限制性内切酶。如果使用多种酶,多个“粘性”突出端可以将切割的 DNA 片段相互连接。这些核酸内切酶只有在识别特定的 DNA 序列(称为限制性位点)时才会切割双链 DNA。在它们连接后,rDNA 组装的最后一步是“粘贴”这些片段,通常使用一种酶 DNA 连接酶。有数百种限制性内切酶,每一种都像一把剪刀一样,识别并切割其特定的 DNA 序列,并使一些 DNA 碱基平齐(“平端”)或不成对(“粘性末端”),


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图 3-6 DNA 合成器。四个橙色小瓶代表试剂,一个用于组装成 DNA 链的每个 DNA 碱基。顶部的计算机界面允许工程师输入他们想要的序列。


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图 3-7 重组 DNA。黑色和蓝色条对代表双链 DNA,颜色编码以显示它在哪里被限制性内切酶切割,留下互补的“粘性末端”(左)或“平末端”(右),可以重新连接,如图所示。


克隆酶的起源

用于克隆 DNA 的酶来源于现有的生物体。例如,细胞需要 DNA 聚合酶在细胞分裂之前复制它们的基因组。限制性内切酶和连接酶在细胞存活和增殖中也发挥着重要作用:


限制酶

细菌细胞使用限制性内切酶来保护自己免受外来 DNA(例如病毒)的侵袭。这些酶进化为切割特定的 DNA 序列,统称为限制性位点。限制性位点通常有四到六个碱基对长。当病毒将其 DNA 注入宿主细胞时,该细胞的限制性内切酶会将 DNA 切割成许多片段,从而阻止其插入宿主基因组并抑制感染。任何给定的细菌种类都只会产生一种或几种类型的限制性内切酶,因为随着细胞中限制性内切酶数量的增加,宿主自身基因组中也存在限制性位点的可能性越来越大。拥有限制性位点的基因组拷贝可能会被证明具有破坏性,因为识别它的限制性内切酶可能会破坏细胞自身的基因组。近 600 种商业限制酶的可用集合来自数百种不同的生物,它们识别宿主基因组中缺失或修饰的限制位点,以防止酶将细胞的 DNA 切割成碎片。

连接酶

细胞通常使用 DNA 连接酶进行 DNA 复制和修复。在复制过程中,一条称为滞后链的 DNA 链在不连续的片段中合成。 DNA 连接酶用于连接这些片段以产生单个连续链。此外,连接酶会重新密封 DNA 主链中的缺口,这些缺口是在 DNA 受损或不正确的核苷酸被切除并被 DNA 复制期间活跃的校对机制取代时产生的。连接酶在分子生物学中用于密封 DNA 碱基对的粘性末端时保留在 DNA 骨架中的切口。


应用 DNA 组装的基础知识

到目前为止,我们专注于制备 DNA 并将其引入细胞的常见方法。接下来,我们将探索如何将不同的 DNA 片段具体而精确地结合起来。为了说明这一点,我们描述了如何使用不同的 DNA 组装策略来制造质粒,这在 iTune 设备章节中占据中心位置。无需阅读该章节即可继续阅读。你需要知道的是,iTunes 实验室调查测试了当基因受到不同强度的调节元件控制时产生多少β-半乳糖苷酶。 iTunes 实验中使用的每个质粒都包括酶编码序列上游的三个可能的启动子之一和三个可能的核糖体结合位点 (RBS) 之一。启动子通过募集 RNA 聚合酶来指导基因的转录,而 RBS 则通过核糖体启动翻译以产生酶(图 3-8)。这些 DNA 元件和一个参考质粒的所有可能组合之前都已组装好。在这里,我们研究了如何使用传统克隆技术(参见第 57 页的“构建 DNA:传统分子克隆”)、BioBrick 组装(在第 60 页的“构建 DNA:BioBrick 组装”中)和 Gibson 组装(“构建DNA:Gibson 组装”,第 66 页)。


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图 3-8 分子生物学的中心法则。在最左边的面板中,RNA 聚合酶(绿豆形状)显示在未缠绕 DNA 的启动子区域附近。启动子区域由启动子(绿色箭头)和 RBS(栗色半圆)组成。在中图中,RNA 聚合酶已与启动子结合并开始转录 mRNA(显示为橙色条带)。显示为紫色形状的核糖体聚集在 mRNA 上的核糖体结合位点附近。右侧显示了 mRNA 向蛋白质的翻译,随着每个核糖体沿 mRNA 进一步翻译,橙色蛋白质的合成也在进行。


正如您将看到的,每种策略都有自己的优点和缺点。传统的分子克隆技术可以可靠地工作,但您必须针对每个新的 DNA 组装挑战现场开发它们,因此它们需要相当多的专业知识才能完美地计划和执行。 BioBrick 组装代表了标准化传统克隆的首批尝试之一。它已获得国际基因工程机器 (iGEM) 团队的广泛认可,因为它与标准生物部件注册表中的许多免费提供的 BioBrick 兼容。 Gibson 组装是一种相对较新的技术,它与 BioBrick 零件兼容,但不需要它们。吉布森组装能够同时组装多条 DNA,被许多人认为代表了 DNA 组装的未来,但它尚未达到成熟工程方法所需的标准化。有一天,Gibson 组装,就像 BioBrick 组装一样,可能会成为一种标准化技术,但与其他新技术一样,标准化落后于创新。

构建 DNA:传统分子克隆

商业 DNA 合成相当便宜,公司以几美分的价格提供服务。它们的自然版本存在,但它们也可以基于具有特定属性的新启动子或 RBS 的想法而发明。他们还经常发送足够的 DNA,以便将其用作最初几个克隆步骤的起始材料。克隆到 iTunes 质粒上的三个元素是启动子、RBS 和 β-半乳糖苷酶的编码序列。 此外,启动子序列很短,大约 35 个碱基,RBS 甚至更短。β-半乳糖苷酶是一种天然存在的酶,由大肠杆菌中的 lacZ 基因编码。产生如此短的起始 DNA 片段的最常见方法是化学合成 DNA 寡聚体,这些寡聚体随后可以在试管中组合以产生所需的双链 DNA 序列。因为 lacZ 基因有一个天然且容易获得的来源,并且因为该基因的序列是已知的,所以 PCR 是制造足够的起始 lacZ DNA 以进行克隆的合乎逻辑的方法。通常,在合成序列的任一端包含限制性位点也是明智的,从而允许对序列进行操作和克隆。如何制造足够的促进剂和 RBS 起始材料就不太明显了。

当 DNA 起始材料在手时,接下来有许多步骤可以使用传统的分子克隆技术将启动子、RBS 和 lacZ 基因克隆到质粒中(见图 3-9)。一般来说,您需要一个从头到尾的策略,因为通常一次只将一段 DNA 插入质粒。例如,为了制作 iTunes 质粒,用两种限制酶切割起始质粒和 lacZ PCR 产物可能是明智的:我们将这些酶称为“C”和“D”。理想情况下,酶 C 和 D 会在片段上留下粘性末端,因此 lacZ 和质粒 DNA 片段可以以可预测的方式相互结合。然后可以将这两个 DNA 片段连接起来,转化到大肠杆菌中,并选择在含有药物的培养基上生长。然后,您可以通过质粒制备从细胞中纯化新的“lacZ+质粒”DNA 的成功克隆,并将它们进行下一步,即添加 RBS。您可以使用限制酶“B”和“C”来进行这种 DNA 组装,这可能会留下粘性末端,使这些 DNA 片段正确对齐。同样,您可以连接这些片段,对其进行转化,然后选择菌落进行后续生长,以产生许多所需质粒的拷贝。在“RBS+lacZ+质粒”DNA 通过对 DNA 进行测序或使用限制性内切酶验证其模式被验证为正确之后,您最终可以使用限制性内切酶“A”和“B”再次切割它,连同起始启动子 DNA 材料“ 这次。再一次,DNA 成分可以被连接、转化、选择,并(最后)制备为最终所需的质粒。


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图 3-9 传统克隆。要使用传统克隆制作单个 iTunes 质粒,可以使用限制性酶“C”和“D”切割骨架质粒,并且可以使用 PCR 来生成两侧带有“C”和“D”限制性位点的所需 DNA。当这些片段连接在一起时,会产生一个新的骨架,然后它会被酶“B”和“C”切割,并与 RBS 的“B”和“C”侧翼 DNA 结合。然后将产生的骨架再切割一次,这次是用酶“A”和“B”,并与“A”和“B”侧翼的 DNA 结合,用于启动子组装最终的 iTunes 质粒。在每一步之间,必须将新的骨架质粒转化到大肠杆菌中并培养,以便提取 DNA,并验证其正确性。


呸!几天后,这种策略可能会产生 iTunes 实验室所需的十种质粒中的一种,如图 3-10 所示(但请参阅第 59 页即将发布的侧边栏“现实生活中的 DNA 工程”以了解这种策略的一些方法)过程可能不成功)。令人高兴的是,您可以重复使用一些作为中间体制成的质粒(例如,“RBS+lacZ+质粒”)来帮助组装其他质粒。通过使用需要存在于所有质粒中的 lacZ 基因开始克隆,您可以并行执行许多后续步骤。


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图 3-10 扩展传统克隆。图 3-9 所示的传统克隆方法可以通过将第一个反应的产物分成三个不同批次,在每个反应中使用不同的 RBS 进行第二个克隆步骤,然后分离将这些产品质粒中的每一个分成三批,用于添加不同启动子的最后一步。此处概述的策略仅在要克隆的片段中不存在所需的限制位点(“A”、“B”、“C”或“D”)时才有效。


总体而言,使用传统克隆,并假设所有步骤都进行得很好,组装所有 iTunes 质粒至少需要几天和大约 13 次消化/连接反应。如果你认为应该有一种不那么特殊和更快的方式来组装 DNA,那么你的想法就像许多合成生物学家所做的那样。 BioBrick 和 Gibson Assembly 是两种方法,部分原因是对传统分子克隆技术的速度和临时性质的不满。


现实生活中的 DNA 工程

我们对传统分子克隆的讨论可能会让这个过程看起来很麻烦,但它实际上呈现了最好的情况。现实生活中的克隆可能会遇到许多障碍,包括行为不端的引物、转化效率低的细胞和无活性的酶。这只是实验室的生活——研究人员有时必须花时间排除故障和优化程序,从各方面来看,这些程序应该有效,但实际上并没有。当您进行一些 BioBuilder 实验室时,您可能会亲自体验到这一点。有完整的实验室手册专门用于解决这些类型的问题,这不是我们的重点。尽管如此,我们还是想介绍一些常见的陷阱,让您更好地了解在实验室中实际进行 DNA 工程意味着什么。


限制酶使用的序列编辑

限制性内切酶是各种基因工程方法的重要工具。工程师使用它们在特定的特征序列处切割 DNA,以便他们可以操纵序列的这一部分,例如通过插入一段新的 DNA。酶的序列特异性对于允许工程师以受控、有针对性的方式实施他们的设计至关重要,但工程师正在使用的 DNA 序列可能需要改变以使其适合与特定的限制酶一起使用。具体来说,除了工程师希望它切割的位置之外,酶的目标序列不得存在于序列中的任何位置。如果序列存在于它不应该存在的地方,工程师必须改变它,也许使用一种称为定点诱变的方法,然后再继续进行其余的克隆。幸运的是,遗传密码的冗余意味着,在大多数情况下,可以在不改变氨基酸序列的情况下改变有问题的序列。例如,如果 DNA 序列中的 TTC 变为 TTT,则 EcoRI 识别位点发生突变,但该序列仍编码苯丙氨酸。

故障排除和更改策略

即使是最精心计划的克隆方案也可能失败,这主要是由于生物系统的一些不可预测的行为。例如,关键酶,包括限制性内切酶、核酸酶和连接酶,如果在冰箱中放置时间过长,它们可能会停止工作。细胞可能会失去转化效率,使工程师根本无法知道之前的克隆步骤是否有效。这些问题中的大多数都相对容易解决——研究人员可以从公司订购新的酶或培养一批新的细胞——但这需要时间,因此挫折加起来。其他实验室问题可能更难解决。有时,某些引物或特定的克隆策略由于任何明显的原因不起作用。这对于总是想知道事情发生的原因的科学家来说可能非常令人沮丧,但通常最好的策略是继续前进并尝试一种全新的方法,因为传统的克隆工具箱足够大,几乎总是有多种方法设计一个特定的序列。


构建 DNA:BioBrick 组装

与传统的分子克隆一样,BioBrick 组装基于使用限制性内切酶和连接酶将 DNA 片段拼凑在一起的策略。然而,由于所有 DNA 片段都是标准化的 BioBrick 部件,因此简化了一些步骤,而完全跳过了其他步骤。 BioBrick 部件被定义为提供特定生物学功能的 DNA 序列。通常,启动子、RBS 和开放阅读框 (ORF) 都被定义为简单的“部分”。每个 BioBrick 部件都有一个唯一的识别部件号。例如,iTunes 质粒上的 lacZ 序列是 BBa_E0051 部分,其中“BBa”代表“BioBrick 系列 a”,E0051 表示该部分在标准生物部件登记处的唯一信息的目录号。 iTunes 质粒上的启动子部分和 RBS 部分也具有唯一的识别部分编号,因此任何有互联网连接的人都可以查找有关其序列和行为的信息。

正如 MIT 的 Tom Knight 博士最初描述的那样,每个标准化 BioBrick 部件都夹在包含 EcoRI 和 XbaI 限制性位点的统一“前缀”序列和包含 SpeI 和 PstI 限制性位点的统一“后缀”序列之间,如如图 3-11 所示。 前缀和后缀上的限制位点经过仔细选择,以便 BioBrick 部件都可以通过单一克隆策略组装。具体来说,一个部分前缀中的 XbaI 限制位点可以连接到用 SpeI 切割第二部分后缀后剩余的粘性末端。这以可预测的顺序连接这两个部分,并使前缀和后缀中最外层的限制性位点保持完整,从而允许生成的组装(称为复合部分)用于另一个组装反应或克隆到质粒中进行表达.换句话说,BioBrick 部件,无论是简单部件还是复合部件,每次都可以以相同的方式切割,以将任何部件连接到任何其他部件。


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图 3-11 标准化的 BioBrick 部件。DNA 编码的功能以蓝色显示,两侧是标准化的前缀序列“P”,它带有两个已知的限制性位点和一个标准化的后缀序列,具有两个不同的限制性位点。


为了说明这一策略,我们可以考虑使用以下 BioBrick 部件构建 iTunes 质粒:

  • BBa_J231106 u003d “中等强度”推广者
  • BBa_B0034 u003d “强” RBS
  • BBa_E0051 u003d lacZ 基因的修改版本。

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值得一提的是,如果我们的组装包括一个未出现在注册表中的 DNA 片段,我们将需要在该过程中添加几个步骤,以使该 DNA 成为标准化的 BioBrick 部件,然后再继续执行后续步骤。这个要求说明了我们在本章前面考虑的标准化的一个方面,即标准化通常需要时间和精力,但从长远来看它可以证明是更有效的。

需要两个组装步骤才能将三个部分放在一起。由于最终 DNA 组装中各部分的顺序很重要,因此必须从一开始就决定要切割哪些部分以及以什么顺序切割。许多选项都可以工作,但对于这个例子,我们假设我们决定首先将强 RBS (BBa_B0034) 放在 lacZ 基因 (BBa_E0051) 的上游。如图 3-12 所示,包含 BBa_B0034 的质粒可以在部分前缀用 EcoRI 切割,在部分后缀用 SpeI 切割。在一个单独的反应中,含有 BBa_E0051 的质粒可以在该部分的前缀中用 XbaI 切割,在其后缀用 PstI 切割。最后,可以用 EcoRI 切割将容纳新组件的目标质粒,以便与 BBa_B0034 的前缀和 PstI 匹配,使其准备好与 BBa_E0051 部分的后缀匹配。

当你组合和连接这三个 DNA 片段时,如图 3-13 所示,得到的质粒带有一个新的复合部分 BBa_B0034+E0051,你可以给它一个新的部分编号:BBa_Xnnnnn。 此新部件符合 BioBrick 标准,因为它具有标准 BioBrick 前缀、原始 B0034 和 E0051 部件之间的“混合”位置,并且后跟标准 BioBrick 后缀。 SpeI 或 XbaI 不再识别原始部件之间的混合位点。相反,B0034+E0051 复合材料部件实际上是一种新的 BioBrick。您可以使用新的零件编号将其输入注册表,并将其与任何其他 BioBrick 组合,如图 3-14 所示。


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图 3-12 BioBrick 组件。 BioBrick 组装需要用 EcoRI 和 SpeI 消化含有上游部分的质粒,用 XbaI 和 PstI 消化含有下游部分的质粒,并用 EcoRI 和 PstI 消化目标质粒。然后将这些片段组合并连接以创建携带新 BioBrick 部分的质粒。


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图 3-13 BioBrick 复合材料部件的组装。即使下游部件是由其他基本部件组装而成的复合部件,组合标准化 BioBrick 部件的策略也不会改变。这是 BioBrick 组装方法的一个关键启用功能。


与传统克隆相比,BioBrick 标准简化了 DNA 组装过程,并允许采用可靠、统一的策略将 DNA 片段拼凑在一起。 BioBrick 组装效率的提高部分归功于其他人的努力,他们事先对零件进行了标准化并将它们贡献给共享资源。 为了有用,BioBrick 部件必须经过改进,以便它们带有预期的前缀和后缀,并且它们本身不会有任何来自部件本身的前缀和后缀的限制位点。细化过程并非微不足道,并且确实需要工作。您可以通过分子生物学家工具包中称为定点诱变的技术或通过 DNA 的直接化学合成来对 DNA 序列进行必要的更改。无论哪种方式,所需的工作都需要能源投资,并且是采用该标准的障碍。也许这就是其他组装标准已经发展起来的原因之一,包括接下来描述的 Gibson 组装方法。


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图 3-14 缩放 BioBrick 组件。要创建整个 iTunes 库,您可以将 ORF BioBrick 与三个不同的 RBS BioBrick 并行组合。然后,您可以将生成的复合 BioBrick 部件分成三批,每批都将与不同的促进剂组合以生产最终的复合 BioBrick 部件。与传统克隆一样,您必须将每个新的复合 BioBrick 部件转化为大肠杆菌并使其生长,以便可以提取和验证 DNA,然后才能将其用作下一个组装步骤的起始材料。


构建 DNA:Gibson 组装

Gibson 组装与传统的克隆和 BioBrick 组装方法相比有几个优点,其中最大的可能是它可以同时组装许多 DNA 部分。即使在其最早的发展阶段,一个吉布森组装反应也可以将大约十个 DNA 部分拼凑在一起。因此,与所描述的其他 DNA 组装方法相比,该技术在效率上显着提高,并且在组装复杂的遗传程序时特别有用,这些程序比我们在此处考虑的 iTunes 质粒集合中发现的部分和变异更多。

Gibson 技术由 J. Craig Venter 研究所的 Daniel Gibson 博士在全基因组组装工作期间开发,它使用 PCR 制备多个 DNA 片段以同时组装(图 3-15)。 PCR 步骤既可以生成足够的 DNA,又可以用短序列修改每个 DNA 部分,这些短序列与最终组装中的配对部分重叠。与预期相邻部分的重叠序列必须至少有 25 个碱基对才能使该技术起作用。在第二步中,根据引入的重叠序列将 PCR 产物粘贴在一起。不需要限制酶或其同源限制位点。相反,一种市售的酶,一种外切核酸酶,会修剪每个 DNA 部分上的一条链,在片段的两端留下一个 DNA 突出端。核酸外切酶没有序列特异性;它只是简单地咀嚼从 3’ 到 5’ 方向移动的任何线性双链 DNA 片段。该反应揭示了由每个 DNA 部分的 PCR 扩增引入的定制“粘性末端”。

将此技术应用于 iTunes 质粒的组装(图 3-16)提出了挑战,因为 iTunes DNA 组装中的某些部分非常短。例如,强 RBS BBa_B0034 只有 12 个碱基对长。可以使用 PCR 将这个带有 25 个碱基重叠的短 RBS 序列附加到其上游侧的启动子,并在其下游侧与 lacZ 基因重叠 25 个碱基。然而,即使每一端都有 25 个碱基,这个短 RBS 部分也不太可能在外切核酸酶处理后存活下来。很有可能它会被咀嚼成虚无!一些变通策略是可能的,但这些策略会将 DNA 组装工作重新变成实验,而不是稳健可靠的“开始”技术。此外,由于您必须为每个组件自定义构建每个部件之间的重叠序列,将 DNA 与这种技术放在一起感觉就像是实验,而不是标准化的工程工具


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图 3-15 吉布森组件。所需最终质粒的不同部分包括功能部分——启动子、RBS 和 ORF——以浅蓝色显示。引导装配顺序和方向的工程侧翼序列由彩色条表示。


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图 3-16 通过 Gibson 组装构建的 iTunes 质粒。最终的 DNA 构建体之一显示在部分之间的彩色条表示序列的部分,这些部分被设计为重叠,以便它们可以在单个组装反应中按顺序相互连接。


下一步是什么?

生物学本质上是可变的和不断变化的,但工程师想要可预测的和功能性的行为。为了弥合这一差距,需要一些创造性的设计思维。最具吸引力的设计可能会利用生物学的独特特性进行自组装,将细胞分子重新用作构建模块,并精确构建。本章的重点是标准化的工程原理,因为它适用于 DNA 组装技术。对于此处描述的每种组装技术,还有一些未包括在内,但最终可能会成为该领域的标准。方法的多样性说明了这一挑战正在吸引的创新想法以及缺乏完美的解决方案(目前!)。

不过,随着时间的推移,这些问题本身可能会演变。设计思维通常会在流程结束时提出与开始时不同的问题。例如,如果您要求一卡车的三脚凳,以便您工厂的工人可以有地方坐下,您可能会发现实际上需要更改的是工作时间表,而您的情况会更好轮班时间更短,工人不那么累,而不是一套椅子。当他们开始谈论铺设跨大西洋电缆时,没有人想到欧姆标准,也许没有人想到设计 DNA 或生物学的最佳方法。

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