第10章金面包

BioBuilder 的 Golden Bread 活动强调设计-构建-测试周期的“构建”阶段。 您将使用一种面包酵母菌株，该酵母菌株已用另一种真菌的基因进行改造，以产生 β-胡萝卜素，这是我们从胡萝卜、红薯和西兰花等食物中自然获得的营养物质。在体内，β-胡萝卜素会转化为维生素 A，这对于视力、免疫系统和其他生物功能至关重要。在一些与营养不良作斗争的发展中国家，维生素 A 缺乏是一个严重的公共卫生问题。研究人员希望，一种旨在产生 β-胡萝卜素的工程化面包酵母菌株（就像您将在本次活动中研究的菌株一样）可以用于面包中，以治疗维生素 A 缺乏症。这种面包由于添加了维生素而呈现金黄色，因此得名“黄金面包”。

对于任何新食品或药物要广泛使用，制造商必须证明他们能够可靠地生产该材料。批次之间的差异不会很大。它必须始终有效。事实上，可靠性对于几乎所有工程工作都至关重要。如果你想一想你最喜欢的工程物体，无论是你的汽车、手机还是冰箱，它的可靠运行可能是它受到喜爱的部分原因。人们讨厌汽车无法启动、电话信号不好以及冰箱变热。我们使这些对象达到相当高的性能标准。事实上，桥梁、ATM 机和投票机等一些工程设备必须始终完美运行。因此，可以公平地说，为了有用，所有工程系统都应该可靠。

在合成生物学领域，可靠性工程师识别生命系统中的不稳定来源，以使系统运行更加可靠。他们有自己的工作要做！ BioBuilder 的 Golden Bread 活动强调如何将科学方法与良好的旧工程知识相结合，以评估并改进不可靠的合成细胞。

工程可靠性

如果你家乡的土木工程师已经完成了他们的工作，你就不会觉得开车过桥是一种可怕的经历。您不必在整个过程中屏住呼吸，担心结构会在您的重量下弯曲或坠落到地面。但现在想一想，这种自信从何而来？我们如何知道桥梁是否安全？

答案是桥梁和其他建筑项目的设计都是为了可靠性。设计人员知道桥梁故障可能是致命的、昂贵的，并且会破坏城市的基础设施，因此他们尽一切努力设计和建造一个可靠的系统。在本章中，我们将介绍一些可靠系统设计的具体方法，例如执行例行定期维护以及使用强度高于最低限度所需的材料进行建造。我们还讨论了如何将这些原理扩展到生物系统工程。

定期维修

想象一下，如果您的汽车永远不需要调整该多好。你永远不需要把它带到商店，它的性能总是和下线那天一样完美。您可以节省大量的时间和金钱，而且您永远不会因故障而感到不便。大多数驾驶员可能会很高兴拥有一辆运行 100% 可靠的汽车。

但司机和汽车制造商，即使他们梦想着如此完美的未来，也知道不存在完全可靠的汽车。汽车会因发动机运动部件的摩擦、机油变脏以及轮胎根据季节需要或多或少的空气而遭受物理磨损。工程师们已尽其所能，最大限度地提高工作汽车中每个部件的可靠性，但期望所有部件无限期地完美运行是不合理的。相反，制造商平衡支持汽车正常使用的强大系统和简单的维护计划，以保持汽车尽可能长时间地正常运行。

那么，当工程师知道随着时间的推移，系统必然会腐蚀然后出现故障时，工程师该怎么办呢？在大多数制造领域，工程师将确定系统及其组件的平均无故障时间 (MTF)。这一确定有助于设计人员预测系统何时会崩溃。它还指导设计人员何时以及如何通过系统的定期维护进行干预。工程师在设计过程中纳入 MTF 计算，以便他们可以建议何时维修零件以及如何使用它们以延长使用寿命。

在工程学教授 Henry Petroski 的一本精彩著作《To Engineer is Human》中，他探索了 MTF，寻找一个熟悉的物体，即回形针。您可能从经验中知道，如果您将回形针弯曲足够多次，它最终会断裂，如图 10-1 所示。从物理角度来看，这种断裂的发生是因为弯曲对金属施加了应力，从而增加了材料的物理缺陷，并且随着缺陷的积累，金属断裂。您可以通过计算回形针断裂前可以弯曲的次数来测量回形针的 MTF。 为了获得对您的数字的信心，您需要在几种不同的条件下重复实验几次，以确定平均 MTF。当然，我们大多数人并不担心修理回形针，因为它们很容易更换，但想象一下您有一个非常有价值的回形针。在这种情况下，您将记录它所经历的弯曲次数，以便您知道何时接近 MTF。很难想象回形针可以做什么“维护”，但如果回形针足够有价值，可能会有一些值得尝试的事情。

当将这些想法应用于生物学时，很明显细胞内置了大部分维护程序。生物系统比汽车或回形针等机械结构更具动态性。大多数细胞在生长过程中都处于近乎恒定的更新状态，然后将其遗传指令传递给新细胞。细胞生长和分裂可靠地产生新鲜细胞的供应。细胞也会自我修复，至少在细胞受到的损伤不太严重时是这样。合成生物学基础章节中讨论的生物学的这些方面是合成生物学如此有吸引力的部分原因。合成生物学家拥有可以用来构建的动态材料（细胞！），因此必须充分利用生物学的特征和能力。

图 10-1 回形针的 MTF。如图所示，来回弯曲回形针最终会导致其断裂。断裂前的弯曲次数可用于计算 MTF。

细胞固有的日常维护能力也有一个缺点。每当细胞复制自己的新副本以取代破旧的版本时，细胞分裂过程就会在 DNA 中引入突变，并传递给子细胞。因此，存在代际差异。这种变异会影响细胞的行为，并导致我们在自然界中发现聪明而美丽的系统。这种变异也给合成生物学家带来了重大障碍。影响系统行为的突变可以接管群体，用不再执行设计功能的新细胞完全取代原始细胞（图10-2）。

因此，为了设计一个可靠的生命系统，合成生物学家必须解决随着时间的推移出现的意外遗传变化。正如我们在 BioBuilder 的其他章节中所看到的，更成熟的工程学科和合成生物学之间的相似之处（尽管它们并不完美）可能会有所帮助，接下来我们考虑一些其他的工程可靠性方法。

图 10-2 代际变异。工程细胞（顶部，蓝色）的分裂可以产生精确的副本（第二行，蓝色）或可能无法执行所需功能的突变变体（第二行，绿色）。如果变体更强大，它可以在几轮分裂后接管种群，如底行所示。

冗余

在工程系统中构建冗余是许多领域使用的另一种技术，以确保更可靠的性能。例如，致力于乘客安全的工程师选择在车祸中同时部署安全带和安全气囊。安全带和安全气囊系统独立工作以实现同一目标。它们的独立控制使得两者在碰撞中发生故障的可能性较小。它们的效果也各不相同。根据碰撞的角度，安全带或安全气囊可能在保护车内人员方面发挥更大的作用。拥有两个安全系统可以增加乘客在碰撞中不受伤害的可能性，因此增加的成本是值得的。然而，并非所有资源密集型裁员都是合理的（图 10-3）。相反，考虑一个威胁较小的工程问题：设计手机。消费者通常期望他们的手机只能使用几年。屏幕可能会破裂，软件需要更新，最新手机的物理功能也会得到改进。由于大多数消费者会更换手机，而不是忍受随着时间的推移而出现的许多缺陷，因此手机设计人员没有动力在手机的电气组件中设计太多冗余。电气系统故障（可能是由于手机变湿或掉落在坚硬的表面上）造成的，虽然会带来不便，但不会危及生命。

这可以通过更换手机来解决，消费者宁愿经常更换手机或购买保险，也不愿提高手机本身的零售价格。

图 10-3 冗余。同时穿着背带和腰带是冗余设计的典型例子。

因此，冗余在其他工程学科中的应用并不均匀，并且是一种资源密集型的可靠性方法，但事实证明它是自然生物系统中相对常见的特征。例如，大多数动物细胞携带两个完整的基因组拷贝，而植物则更进一步，有时携带六到八个基因组拷贝。 活细胞中的冗余对于它们的生存很重要，因为 DNA 可能会被细胞环境中的诱变剂损坏。暴露在阳光或诱变剂下会引起 DNA 序列的变化，使一些遗传指令基本上无法读取。遗传冗余为细胞提供了一些保险。即使其中一个 DNA 拷贝被损坏，另一个 DNA 拷贝也可能保持完整，并且还可以作为修复受损拷贝的模板。细胞必须在能源和原材料方面为这种保险付出高昂的代价，但基因组“额外”副本的成本可以通过其遗传指令的安全性得到补偿。鉴于遗传冗余是大多数多细胞生物的标准特征，进化优势必定超过成本。

合成生物学家可以通过使用特定 DNA 序列的多个副本来设计他们的系统，从而引入遗传冗余。这可以通过用额外的质粒转化细胞或将某些基因的额外拷贝插入细胞的基因组来完成。这些遗传技巧可以通过为细胞提供基因的备份副本来增强基因电路的稳定性，以便在其他副本失败时使用。但令人惊讶的是，它也会破坏系统的稳定性。一些生物体，例如酵母，已经学会识别并去除 DNA 的直接重复序列。基因产物表达过多也存在危险。细胞是极其高效的系统，因此维持和表达额外的遗传物质可能会耗费大量能量，从而增加细胞的代谢负担或破坏工程系统的平衡。有一些方法可以解决这些缺陷，例如像我们在金面包实验中所做的那样，对冗余基因进行密码子改组，或者对冗余基因的表达添加一些调节。然而，成本/效益分析并不容易，而且目前还不清楚在将可靠性设计到生命系统中时应遵循哪些一般规则。

构建强大的系统

我们将在这里讨论的工程可靠性的最终方法是构建一个比严格必要的更强大的系统。例如，在建造一座桥梁时，工程师可以使用能够支撑 60 吨卡车的材料进行设计，因为他们知道大多数州卡车的最大法定重量为 40 吨。同样，他们可以设计一座能够承受里氏 10 级地震的桥梁，因为他们知道有史以来最大的地震是 9.5 级。为了充分设计如此强大的系统，工程师可以使用建模方法来预测其设计和材料对卡车和地震的反应。图片本章提供有关建模的更多信息，并考虑模型如何为不同压力下的系统提供良好的数据。

设计过于稳健的系统的缺点是相关的成本。例如，建造如此超强桥梁的材料可能比能够承受桥梁实际预期应力的材料贵得多。大多数产品设计师都会理性地选择材料，通常会使用称为阿什比图的工具将可能材料的强度与其成本进行比较。通常，他们还会考虑与设计过于强大的系统相关的额外时间以及该时间的成本。与在足够的系统中构建的标准材料相比，超级材料的构建、采购或维护可能更复杂。亨利·彼得罗斯基（Henry Petroski）的另一本精彩著作《有用事物的演变》在其“小钱变大钱”一章的大部分内容中描述了一个看似平凡的工程项目，即床架上板条的工程。 Pertoski 追溯了为什么板条与框架成直角而不是对角穿过框架的问题（图 10-4）。事实证明，这个看似简单的问题早在亚里士多德就已经提出过，并且在荷马的《奥德赛》中也得到了考虑，当时奥德修斯建造了一张必须固定在橄榄树上并用皮带穿过的新娘床。令人惊讶的是，在大多数有记录的历史中，带有对角板条的床的经济性和维护被认为是不合理的！

图 10-4 平衡稳健性和成本。仅具有水平板条的床（左）不如具有对角板条网格的床（右）坚固，但前者比后者便宜。多年来，工程师在这种情况下一再选择成本较低的设计。

当材料选择扩展到生物系统的设计时会是什么样子？也许“强度”是指系统中不同蛋白质的表达水平，底盘本身的可预测生长，或者用于零件和设备的蛋白质的物理特性。 需要加强的生物系统的相关方面将取决于具体设计及其预期用途。

考虑一个系统，例如生物设计基础章节中的砷传感器，或任何其他与此相关的环境传感器。与使用超强钢建造桥梁的生物学类似，可以设计具有许多蛋白质传感器设备副本的系统，或者使用比严格必要的更灵敏的传感器。通过这些修改，您可以放心，即使是微量的触发化合物也会被传感器检测到并启动您想要的细胞反应。此外，即使基因中的有害突变随着时间的推移而积累，传感器也可以继续发挥作用，因为它的设计功能已经超出了规格。在这种情况下，需要权衡的是触发误报的可能性。高亲和力砷传感器现在可以识别类似的、毒性较小的化合物，甚至在根本不存在任何配体的情况下打开。编码如此高产量的传感器蛋白的系统在代谢上也可能是“昂贵的”，需要大量的细胞能量来维持高产量水平。细胞的许多资源将仅用于设计的系统，而不是细胞保持健康所需的其他基线代谢和修复系统。 使用蜂窝资源来设计可靠性最终可能会对细胞的健康产生负面影响，从而干扰工程系统的功能。事实上，代谢压力可能会减缓细胞的生长并降低工程系统的性能——这与工程师在引入更多传感器副本时试图做的事情恰恰相反。

此外，如果工程细胞处于进化劣势，它们将被生长更快的新突变体所取代，如前所述。根据工程细胞及其突变版本的生长速度，进化之战可能会在短短几代内失败。因此，毫不奇怪，合成生物学家正在采用基因设计原理，使它们的部件“更强”，因为它们不太可能发生突变。例如，由于相同的 DNA 序列经常通过重组被删除，因此通常会避免遗传元件的直接重复。合成生物学家可以利用遗传密码中的简并性来改变冗余 DNA 部分的序列，例如用 TTG 或 CTA 编码亮氨酸。这个技巧使得同一个蛋白质可以由两个不同的 DNA 序列编码，而这两个序列不太容易重组。通过用两个基因编码该功能，可能会使系统表现得更加可靠。您将通过 Golden Bread 工程活动直接测试这个概念。

合成生物学家还拥有一些工具来增强他们使用的底盘，使它们不易受到意外变化的影响（图 10-5）。有些菌株具有改进的 DNA 修复机制。其他基因已被修改，以减少突变诱导过程或丰富有助于蛋白质适当折叠的机制，这可能允许轻微突变的蛋白质正常发挥作用。最后，一些底盘设计有“终止开关”，或一种自毁手段，因此任何变异偏离所需行为的细胞都可以从群体中移除。然而，这些都不是万无一失的。因此，合成生物学的活跃研究领域之一是设计更安全、更可靠的底盘。

图 10-5 自校正系统。工程细胞（顶部，蓝色）的分裂可以创建精确的副本（第二行，蓝色），或者可能导致产生可能无法执行所需功能的遗传变体（第二行，绿色）。为了防止这些不需要的变异在群体中持续存在，工程师可以设计组件来杀死这些细胞，如红线所示，以确保系统可靠运行。

“VitaYeast” iGEM 项目的背景

动机

获得足够维生素 A 的唯一方法是通过健康饮食或维生素补充剂。全球有超过 2 亿学龄前儿童无法通过任何一种方式获取维生素 A，他们的维生素 A 缺乏会对他们的视力和整体健康造成重大影响。维生素 A 在体内由 β-胡萝卜素加工而成，是视黄醛的前体，视黄醛是视力所需的化学物质。它也是视黄酸的前体，视黄酸对于健康的免疫系统和发育至关重要。甘薯、胡萝卜、西兰花和绿叶蔬菜中含有丰富的维生素 A，但在这些食物不生长或不生长的地方，维生素 A 缺乏 (VAD) 是一个主要的健康问题经常食用。

世界卫生组织估计，维生素 A 补充剂可以将 5 岁以下儿童的死亡率降低 24% 至 34%。然而，向农村地区分发补充剂可能很困难且成本高昂，因此不是应对这一健康挑战的可持续解决方案。因此，一些研究人员旨在开发一种本身富含维生素A的主食。2000年，一个欧洲研究小组宣布开发出这样一种食品：一种经过基因改造表达β-胡萝卜素的“黄金大米”品种。。水稻经过改造后能够表达三种酶，这些酶可以从大米中一种名为香叶基香叶基二磷酸的天然化合物中产生β-胡萝卜素。由于β-胡萝卜素的存在，又被称为“维生素A原”，因为它在体内可转化为维生素A（图10-6），使米粒呈现金黄色，因而得名。 “黄金大米”（图10-7）。

图 10-6 维生素 A 合成。人类通过食用富含 β-胡萝卜素的饮食来获取维生素 A，也称为视黄醇，β-胡萝卜素在消化过程中会分解成两个维生素 A 分子。

研究人员希望将浓缩大米分发到大米是当地饮食主要组成部分且 VAD 构成健康挑战的地方。然而，他们遇到了强烈的反对。环保团体和个人担心生物工程食品对该地区个人健康、生态系统和经济的潜在负面影响。黄金大米的反对者限制了它的分发，因此它是否能减少 VAD 死亡的问题没有得到解答。许多这些问题背后的信念和概念可以引发充满活力的课堂讨论，生物伦理学基础章节提供了引导此类讨论的方法。

图 10-7 黄金大米。黄金大米是富含β-胡萝卜素的白米，摄入后会转化为维生素A。

2011 年，约翰·霍普金斯大学的国际基因工程机器 (iGEM) 团队寻求不同的解决方案来打破 VAD/黄金大米的僵局。该团队没有在主要食物来源中添加 β-胡萝卜素并将其颜色改变为不自然的颜色，而是决定使用面包酵母的工程版本，扩展了研究人员 2007 年发表的一些研究成果，这些研究人员对常见菌株酿酒酵母进行了基因改造，除了正常的遗传信息补充外，还表达三个 β-胡萝卜素生物合成基因（图 10-8）。 iGEM 团队的想法是用这种酵母替代标准面包酵母，使用户能够烘焙营养丰富的面包。不需要特殊的烘焙说明。用户只需在他们的标准面包配方中添加一点工程“VitaYeast”即可（图 10-9）。 iGEM 团队希望这一解决方案能够缓解围绕黄金大米引起的一些担忧。工程酵母将是维生素强化面包的次要成分。此外，酵母在面包烘烤过程中会被杀死，所得的面包应呈现自然颜色，而不是合成颜色和令人倒胃口的颜色。

图 10-8 β-胡萝卜素生物合成途径。用于改造 VitaYeast 的代谢途径由三种酶（灰色圆圈）组成，它们将磷酸法尼酯（顶部菱形）转化为 β-胡萝卜素（底部菱形）。该途径中的前三种化合物是无色的，后三种化合物分别为黄色、红色和橙色。此处显示的酶功能为 crtE，天然存在于面包酵母中，但由名为 BTS1 的基因编码；另外两种酶 crtYB 和 crtI 是从红色真菌 X. dendrorhous 中作为基因导入的。

图 10-9 富集酵母。有一天，一种市售的“VitaYeast”可以代替面包酵母来解决全球维生素 A 缺乏的问题。

零件级和设备级设计

尽管iGEM团队的“VitaYeast”项目是受黄金大米项目推动并有许多相似之处，但大米和酵母系统的生物学特性却存在重要差异。由于这个原因（也可能是其他原因），VitaYeast 中的基因回路源自真菌，而黄金大米的基因回路则源自植物。首先开发 VitaYeast 菌株的研究人员引入了一种来自红色酵母 Xanthophyllomyces dendrorhous 的生物合成途径，该酵母天然产生类胡萝卜素化合物，并且具有可用于生产 β-胡萝卜素的酶。相比之下，黄金大米的开发者引入了三种植物基因，将大米中天然存在的香叶基香叶基二磷酸转化为β-胡萝卜素。

与大米一样，面包酵母酿酒酵母可以自然产生二磷酸法呢酯，这是合成 β-胡萝卜素的起始化合物。然而，这些酵母还表达一种由 BTS1 基因编码的酶，可将法呢基二磷酸转化为香叶基香叶基二磷酸。将香叶基香叶基二磷酸转化为 β-胡萝卜素需要两种酶 crtYB 和 crtI 的作用，这两种酶是从红色酵母导入面包酵母的。这些酶中的每一种都有双重作用。 crtYB 酶在合成的早期发挥作用，将香叶基香叶基二磷酸转化为八氢番茄红素，然后在合成的最后一步重新发挥作用，将番茄红素转化为 β-胡萝卜素。 crtYB 催化步骤之间有两个反应，需要 crtI 酶的活性，该酶也从红色真菌导入面包酵母菌株中。该酶首先将八氢番茄红素转化为神经孢子烯，然后转化为番茄红素。

大自然提供了一种简单的方法来检测该途径产生的色素。酵母使β-胡萝卜素变成亮橙色（图10-10）。或者，酵母只使番茄红素像番茄一样变红，番茄红素天然浓度很高。最后，神经孢子烯是该途径中的黄色中间体。然而，颜色编码到此为止，因为该途径中较早的化合物具有少于七个共轭双键，因此是无色的。然而，该途径中的三种有色产物使得更容易确定哪些酶起作用以及哪些菌株产生所需的化合物。

图 10-10 VitaYeast 设计。通过添加合成 β-胡萝卜素（中）的酶途径对面包酵母（左）进行改造，产生了一种可用于烘焙的新型橙色 β-胡萝卜素合成酵母。

当构建 VitaYeast 菌株的研究人员看到它的橙色时，他们可能会欣喜若狂。然而，仔细观察他们所做的事情，他们一定很快意识到，并非所有殖民地的行为都符合他们的预期和希望。尽管事实上它们都来自同一个遗传父母，并且本身的基因应该是相同的，但有些是橙色的，有些是红色的，有些是黄色的，有些是白色的。一种可能的假设是，这些不同颜色的酵母“卡在”生物合成途径的中间步骤。了解这一假设是否确实是五彩酵母的原因并解决问题是 BioBuilder Golden Bread 活动的核心。

设计和构建初始“VitaYeast”菌株的研究人员采用了两种方法来提高其 β-胡萝卜素生产的可靠性。 首先，他们试图建立一个更强大的系统。 特别是，他们停止使用表达红色酵母基因的易于使用的质粒。他们没有使用质粒，而是将 crtYB 和 crtI 基因转移到他们正在构建的面包酵母的染色体中。这些基因的整合副本不太可能丢失，因此菌株应该更可靠地呈现橙色。这种方法的缺点是，当基因位于染色体中时，它们也更难处理，因为遗传物质在实验室中不容易操作，但在这种情况下，研究人员认为系统可靠性的提高将值得在使用它时增加更多的麻烦。

其次，他们尝试通过添加冗余基因来提高β-胡萝卜素的产量，为催化途径第一步的酶添加第二个基因拷贝。最初，他们依靠面包酵母的天然酶 BTS1 将法呢基二磷酸转化为香叶基香叶基二磷酸，但在优化系统的工作中，他们发现，如果他们提供 β-胡萝卜素的产量，就可以增加 β-胡萝卜素的产量。通过在该路径的第一步中引入一些冗余来启动。他们从红色酵母中引入了另一种酶 crtE，以帮助将法尼基二磷酸转化为香叶基香叶基二磷酸。那么，他们的最终系统在一定程度上依赖于冗余来保证可靠性。它包含两个基因：crtE 和 BTS1，尽管它们的 DNA 和蛋白质序列完全不同，但它们都能产生进行 β-胡萝卜素生物合成第一个生化反应的酶。

最后，研究人员通过一项额外的修改改进了系统。他们确定可以通过包含 crtI 基因的第二个拷贝来增加 β-胡萝卜素的产量。在这种情况下，研究人员怀疑额外的 crtI 基因的可靠性增加是由于酶的表达水平增加，而不是我们在前面部分中讨论的冗余的其他优点，例如在第一个情况下有一个额外的副本可用复制失败。

感谢研究人员对这种 VitaYeast 菌株进行的所有巧妙的基因工程，我们现在拥有了一种呈亮橙色的酵母菌株，2011 年霍普金斯大学的 iGEM 团队可以使用它。 然而，令团队非常失望的是，为可靠性而设计的应变仍然不是 100% 的橙色。将这种酵母菌株的单个菌落重新划线到培养皿上会产生橙色菌落，但也会产生一些红色、黄色和白色菌落。 BioBuilder 的 Golden Bread 活动研究了这种不稳定性，并尝试了提高菌株性能的方法。

额外阅读和资源

阿什比，M.F. (1999) 机械设计中的材料选择 [ISBN: 0750643579]。
Petroski, H. (1985) 《工程师就是人：失败在成功设计中的作用》[ISBN: 0679734163]。
Petroski, H. (1994) 实用物品的演变：日常用品——从叉子和别针到回形针和拉链——是如何形成的。 [ISBN：0679740392]。
Verwaal，R. 等人。通过用来自树状叶黄酵母 Appl Environ Microbiol 的胡萝卜素基因连续转化，在酿酒酵母中高水平生产 β-胡萝卜素。 2007；73(13)：4342-50。
网站：黄金大米。
网站：世界卫生组织，微量营养素缺乏症。

金面包实验室

该实验室向学生介绍真核实验生物酿酒酵母，其生长速度和基因操作方法与大肠杆菌不同。出于工程可靠性的目标，该实验试图表征菌株的不稳定性，使用菌落 PCR 评估其可能的遗传来源。通过用含有工程途径中基因之一的合成版本的质粒转化酵母，强调了冗余的工程概念。您可以使用 Golden Bread 实验室程序来教授生物技术技能，例如固态微生物培养和 DNA 电泳。

设计选择

使用单一基因程序构建的单一酵母菌株可以产生多种颜色的酵母，这一事实表明，VitaYeast 菌株无法像生物工程师希望的那样可靠地生产 β-胡萝卜素。为了调查不可靠性的根源，我们首先假设不同的菌落颜色是由遗传不稳定性造成的，即细胞分裂时β-胡萝卜素代谢途径中一个或多个基因的变化。 您将进行实验来量化不可靠性的程度并评估遗传变化发生的位置。

在这些活动中，您将特别关注 crtYB 基因，因为它是系统中唯一没有任何已设计到 β-胡萝卜素生产途径中的遗传冗余的部分。然而，重要的是要认识到，这种不可靠性可能还有其他解释，包括主要不参与β-胡萝卜素途径的基因的作用，或完全非遗传的原因，例如生长培养基的差异。尽管我们不会在这里研究这些其他潜在的不可靠性来源，但它们代表了出色的后续实验。

实验问题

我们将研究并尝试使用经过验证的冗余工程策略来修复 VitaYeast 菌株的遗传不稳定性。通过将注意力集中在一个特定基因 crtYB 上，我们有效地将实验问题缩小到一个简单且可测试的问题：向 VitaYeast 菌株中添加合成的 crtYB 基因 crtYB’ 是否会减少或完全消除酵母菌的生长非橙色（即红色、黄色、白色）菌落？

为了解决这个问题，我们需要比较两个值：

添加 crtYB’ 之前，红色、黄色和白色菌落相对于橙色菌落的数量，或非橙色菌落的百分比。
添加 crtYB’ 后非橙色菌落的百分比。

如果百分比下降，我们可以得出结论，冗余实际上减少了系统中的遗传不稳定性。如果百分比保持不变，也许我们应该尝试添加一个或多个不同的基因，或者完全采取另一种方法。如果百分比增加，我们可能会质疑我们用于引入合成基因的程序是否会产生意想不到的副作用。

通过思考实验可能的结果，我们可以更好地设计必要的控制。对于在质粒上引入 crtYB 新副本的转化过程，我们可以想象使用阴性和阳性对照。 转化的阴性对照是我们不希望在我们的选择平板上生长的样品，在这种情况下，平板缺乏必需氨基酸，因为它不包含带有选择标记的质粒，该基因产生相同的必需氨基酸。为了准备该样品，我们需要执行与实验样品相同的所有步骤，但不添加质粒 DNA。如果阴性对照确实生长，与我们的预期相反，我们知道有关程序或平板的某些因素无法有效地将转化细胞与没有质粒 DNA 的细胞分开。

阳性对照可以帮助我们解决有关转化过程中意外副作用的问题。 我们期望阳性对照在选择板上生长，但不希望它包含 crtYB 的额外副本（这将使其与我们的实验样本相同）。因此，对于我们的阳性对照，我们将用包含选择性标记但不含 crtYB 副本的“空”质粒转化酵母。现在，让我们回到我们的“思想”实验：如果遗传不稳定性在转化后增加怎么办？通过与阳性对照进行比较，我们可以确定是否是 crtYB’ 或单独的转化导致了这种意外结果。事实上，转化是一个严酷的过程，可能会导致酵母 DNA 发生意外变化，因此排除这种可能的遗传不稳定来源非常重要。

我们的实验样品将包含 VitaYeast 和包含选择性标记和 crtYB 基因的质粒。我们将比较转化后非橙色菌落与阳性对照平板上的菌落的百分比。这将提供最直接的同类比较，并使我们能够将任何颜色变化归因于 crtYB’ 基因本身，而不是任何其他混杂因素。

入门

您将收到一种已经含有工程化 β-胡萝卜素途径的酵母菌株。您将首先进行自己的简单实验，通过重新划线橙色酵母并计算橙色、红色、黄色和白色菌落的数量来测量 β-胡萝卜素生产的可靠性。

然后，您将开始处理一个或多个非橙色菌落。您将进行 PCR 实验以确定 crtYB 基因是否仍然存在。回想一下，crtYB 是系统中唯一没有冗余副本的基因。我们将提供用于扩增 crtYB 的引物，但您也可以自己为该基因或途径中的其他基因设计引物。

我们还将为您提供一个含有 crtYB 基因冗余但合成副本的质粒，我们将其称为 crtYB’。该基因产生与原始 crtYB 基因相同的蛋白质产物，但用密码子改组的 DNA 序列对其进行编码。由于遗传密码的简并性，基因的重新编码得以发生。与 PCR 实验一样，您也可以自行设计这个冗余副本。您将把这个多余的 crtYB 副本转化为红色、橙色、黄色或白色酵母。转化方案与转化大肠杆菌的方案略有不同，但基本原理是相同的。将转化反应铺板并使菌株生长 2 天后，您将计算不同颜色的菌落数量，以评估引入这种冗余是否使系统运行更可靠。

本实验的酵母菌株含有整合到其染色体 DNA 中的产生 β-胡萝卜素的遗传电路。酵母将以“刺”或“斜”的形式到达，即在倾斜介质上装有少量酵母的试管。

使用无菌牙签或接种环将酵母划线到培养皿上：从牙签或接种环上的刺处收集少量细胞，并将细胞转移到含有酵母提取物蛋白胨葡萄糖培养基 (YPD) 的培养皿中琼脂。
将这些培养皿培养基面朝上放入 30°C 培养箱中 36-48 小时。平板也可以在室温下孵育，但细胞生长会更慢。

实验室协议

这是实验室协议的缩写版本，仅包括转化活动。 BioBuilder 网站上提供了菌落 PCR 和设计冗余合成基因的说明。

这些说明使用酵母转化试剂盒来制备感受态细胞。该试剂盒的内容是专有的，但如果您在谷歌上搜索化学感受态酵母细胞，很可能会找到这些内容。

改造 VitaYeast

对于您想要执行的每个转化（阳性对照、阴性对照、实验），给微量离心管贴上标签。然后加入 500 微升水，并用牙签在每个试管中摇动装满产生维生素 A 的酵母。
在微量离心机中旋转试管 30 秒，收获酵母。
将每个颗粒的上清液吸出或移入装有 10% 漂白剂的废烧杯中，以除去上清液。您不必除去每一滴上清液。
将每个细胞沉淀重悬于试剂盒中的 500 μl“洗涤溶液”或“溶液 1”（很可能只是无菌水！）中进行洗涤。
在微量离心机中全速旋转 30 秒收获细胞。
如前所述吸出或除去上清液。
将每个沉淀重悬于 50 μl 的“感受态溶液”或“溶液 2”（最有可能是醋酸锂和 DTT，它通过未知机制使酵母透化）。与化学感受态细菌不同，感受态酵母在这种状态下并不“脆弱”，并且可以保持在室温下。
在阴性对照管中加入 5 μl 水。轻弹管子以混合内容物。该试管不含 DNA。
将 5 µl pRS414 DNA (50 ng) 添加到阳性对照管中。轻弹管子以混合内容物。该质粒带有酵母复制起点和 TRP1 基因，可作为转化的阳性对照。
将 5 µl pRS414+crtYB’ DNA (50 ng) 添加到实验样品管中。轻弹管子以混合内容物。
向每个试管中添加 500 µl“转化溶液”或“溶液 3”到细胞中。这种材料很可能是聚乙二醇（“PEG”又名防冻剂），粘稠且粘稠，包含在转化方案中以帮助将 DNA 传递到酵母中。使用 P1000 将溶液与酵母一起上下移液，然后轻轻涡旋试管以形成均匀的悬浮液。
将管子与等量的 -TRP 板一起在 30°C 下孵育约 1 小时，盖子半开，以蒸发其表面上的水分。在这一小时内，您可以定期“轻弹”试管以混合内容物；这将有助于防止细胞沉降到底部。
至少一小时后，轻弹试管以混合内容物，然后将 250 μl 每种混合物涂在适当标记的 -TRP 板上。
将培养皿介质面朝上，在室温下或在 30°C 培养箱中培养两天。
返回收集数据后，确定每个培养皿上菌落的数量和颜色。

金面包

第10章 金面包